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本文格式为Word版,下载可任意编辑——流式细胞检测方法AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡试剂盒使用(细菌)
K:不加菲A:5000ug/L菲B:500ug/LC:500ug/L
1、在0,24,48,72h取样3ml,测定OD600
2、在0,24,48,72h取样,三个平行各取1ml,混匀,6000r/min,离心20分钟,弃上清,收集细胞,用5mlPBS轻轻重悬(注意:PBS重悬不能省略,PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用,可以保证后续AnnexinV-FITC的结合。)
3、试验组(4组):取K、A、B、C组重悬的细胞,参与5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟,弃上清。
4、试验组:各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml左右,混匀。参与10μlAnnexinV-FITC,轻轻混匀;再参与100μl碘化丙啶,轻轻混匀。室温(20~25℃)避光孵育10分钟。
5、阳性对照组:取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min(杀死细胞),然后参与100μl碘化丙啶(PI)单染,轻轻混匀,另1管参与10ulAnnexinV-FITC单染,轻轻混匀。室温(20~25℃)避光孵育10分钟。6、阴性对照组:另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml,混匀,不加任何染色剂。
7、将样品过400目筛网,进行流式细胞仪检测。8、AnnexinV-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光。
9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同,因而流式检测的荧光补偿也不同,因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照,进行荧光补偿的调理。
10、用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488nm;发射波长Em=530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测,建议使用FL3。荧光补偿调理:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调理去除光谱重叠和设定十字门的位置。二醋酸酯荧光素(FDA)与碘化丙啶的流式细胞术1、在0,24,48,72h取样3ml,测定OD600
2、在0,24,48,72h取样,三个平行各取1ml,混匀,6000r/min,离心20分钟,弃上清,收集细胞,用5mlPBS轻轻重悬
3、取K、A、B、C组重悬的细胞,参与5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟,弃上清。
4、试验组:各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml左右,混匀。参与200μlFDA,轻轻混匀;再参与100μl碘化丙啶,轻轻混匀。室温(20~25℃)避光孵育10分钟。5、阳性对照组:取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min(杀死细胞),然后参与100μl碘化丙啶(PI)单染,轻轻混匀,另1管参与200ulFDA单染,轻轻混匀。室温(20~25℃)避光孵育10分钟。
6、阴性对照组:另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中,定容至1ml,混匀,不加任何染色剂。
7、将样品过400目筛网,进行流式细胞仪检测。
8、二乙酸荧光素(FDA)本身无荧光。在细胞的非特异性脂酶的催化下,FDA生成荧光素,后者经480nm激光激发出波长530nm左右的绿色荧光。死细胞的细胞膜不完整,生成的荧光素很快扩散出细胞,不能检测到带有绿色荧光的细胞。碘化丙锭(PI)不能进入具有完整细胞膜的活细胞,当细胞死亡或细胞膜不完整时,PI进入细胞,与DNA相结合,在488nm的激光激发下,在波长660nm左右检测到红色荧光。因此,通过FDA/PI双染色的方法,利用死活细胞在
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