治疗自身免疫性疾病新靶标与相关新药研发

治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先导药物研发

靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用

第一页，共76页。自身免疫疾病自身免疫性疾病（autoimmunediseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。

系统性自身免疫病（非器官特异性）器官特异性自身免疫病系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus)类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis）口眼干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)结节性多发性动脉炎(polyarteritisnodosa)慢性淋巴细胞性甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)多发性硬化症(multiplesclerosis)重症肌无力(myastheniagravis)胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus)第二页，共76页。临床上主要的自身免疫病及其相关证据第三页，共76页。人类自身免疫病的致病性自身抗原第四页，共76页。全球有5-8%的人口受到约40种自身免疫疾病的威胁！自身免疫疾病已被我国列为“十大”严重影响人民健康的疾病之一。系统性红斑狼疮

类风湿性关节炎多发性硬化症第五页，共76页。自身免疫病的共同特征1、多数自身免疫性疾病病因不明；2、患者女性多见，发病率随年龄增高，有遗传倾向；3、存在自身抗体和（或）自身反应性T细胞；4、疾病的重叠现象；5、病程迁延，发作与缓解交替；6、免疫抑制剂治疗有一定疗效第六页，共76页。自身抗原的出现

隐蔽抗原的释放、自身抗原发生改变

免疫调节异常淋巴细胞的多克隆激活、Th1和Th2细胞功能失调交叉抗原链球菌感染、EB病毒感染、柯萨奇病毒感染表位扩展遗传因素发病机制免疫耐受性的终止和破坏是自身免疫病发生的根本机制。确切原因尚未完全阐明，可能与下列因素有关：第七页，共76页。发病机制第八页，共76页。治疗策略免疫抑制剂皮质激素：强的松，可的松细胞毒性药物：烷化剂，嘌呤拮抗剂等抗感染抗菌素：环孢子菌素、氯霉素细胞因子及受体抗体或阻断剂生物学制剂：抗淋巴细胞球蛋白、细胞因子单抗、细胞因子受体拮抗剂

缺点：不能根治，且对肝脏和肾脏有毒性，长期使用有致感染和致癌作用，导致不育和畸形，副作用强理想的治疗策略：选择性的抑制自身免疫而不影响正常免疫功能，毒副作用弱第九页，共76页。T细胞引起自身免疫的信号通路T细胞和自身免疫疾病选择性抑制T细胞的激活和增殖的免疫抑制剂可以有效的治疗自身免疫疾病。第十页，共76页。

电压门控钾通道亚型Kv1.3中等电导钙激活钾通道(IKCa1)

T细胞中的钾离子通道与钾通道Kv1.3和IKCa1相关的T细胞激活过程第十一页，共76页。T细胞的分类

根据T细胞表面CD45分子，将T细胞分为二个新亚群。凡未经抗原刺激的T细胞可称之为原始T细胞（naiveTcell,Tn）为CD45RA+T细胞群，而经抗原刺激分化为记忆T细胞（memoryTcell,Tm）为CD45RO+细胞群。特性TnTmCD45CD45RACD45RO归巢受休表达高水平低水平粘附分子表达低水平高水平再循环血流→淋巴组织直接移行至抗原部位寿命短（数日）长（数月）再次抗原刺激-+++第十二页，共76页。T细胞的分类

记忆T细胞（memoryTcell,Tm）根据其表面受体CCR7分子的表达和功能不同，可分为TEM（CCR7-）和TCM

（CCR7+）细胞。第十三页，共76页。钾通道Kv1.3和IKCa1在不同T细胞中的表达第十四页，共76页。第十五页，共76页。钾离子通道2003年诺贝尔奖钾离子通道是一类细胞膜上选择性允许K+跨膜通过的离子通道，是继G-蛋白偶联受体和蛋白激酶之后的第三大信号转导分子家族。第十六页，共76页。第十七页，共76页。治疗自身免疫疾病的新靶标：钾通道Kv1.3钾通道Kv1.3结构示意图

TEM细胞的异常增殖在自身免疫疾病中起重要的作用，钾通道Kv1.3成为了治疗自身免疫疾病的一个新的药物靶标。

第十八页，共76页。治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先导药物研发

靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用

第十九页，共76页。有机小分子调节剂的筛选与设计靶向钾通道Kv1.3的药物研发多肽调节剂的筛选与设计第二十页，共76页。有机小分子调节剂的筛选与设计

1998年，Merck公司就分离到correolide，它能在100nM水平上抑制T细胞的增殖。随后Merck、Pfzer等研发机构分离、合成、和功能鉴定了10多种有机小分子药物候选物。第二十一页，共76页。

有机小分子先导药物的不足：作用于Kv1.3钾通道的选择性和特异性不强有机小分子的药理学活性有机小分子调节剂的筛选与设计第二十二页，共76页。多肽调节剂的筛选与设计

自然界中的有毒动物

多肽药物的筛选与设计

以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计第二十三页，共76页。海葵毒素多肽药物的研发选择性较好的SL5多肽药理学活性海葵毒素Shk海葵第二十四页，共76页。第二十五页，共76页。第二十六页，共76页。第二十七页，共76页。第二十八页，共76页。多肽调节剂的筛选与设计

自然界中的有毒动物

多肽药物的筛选与设计

以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计

以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计

第二十九页，共76页。以蝎毒肽为基础的药物研发

作为天然的毒素资源库，蝎毒肽比海葵毒素更丰富。蝎作用于钾离子通道的蝎毒肽第三十页，共76页。第三十一页，共76页。如何获得对钾通道Kv1.3高选择性和特异性的多肽调节剂？

从蝎毒肽中天然分离以蝎毒肽为模板进行设计和改造第三十二页，共76页。天然的蝎毒肽包含多种作用于Kv1.3通道的成员，但选择性和特异性普遍不高。第三十三页，共76页。ImKTx88的筛选和序列分析从海南斑等蝎（Isometrusmaculates）毒腺组织cDNA文库中筛选出钾通道蝎毒肽ImKTx88基因。天然蝎毒肽调节剂的筛选第三十四页，共76页。第三十五页，共76页。多肽ImKTx88的表达纯化和质谱鉴定第三十六页，共76页。第三十七页，共76页。

2005年，法国科学家Jean-Marc等改造蝎钾毒素多肽OSK1获得了特异作用于Kv1.3通道的多肽AOSK1。以蝎毒肽为模板的多肽调节剂设计和改造第三十八页，共76页。第三十九页，共76页。AOSK1及其突变体对Kv1.3的特异性和选择性比较第四十页，共76页。2008年，武汉大学依据已建立的多种蝎毒腺cDNA文库，结合蝎毒肽的结构与功能研究，设计筛选获得了选择性和特异性作用于Kv1.3通道的多肽ADWX-1。靶向钾通道Kv1.3先导药物多肽ADWX-1的筛选第四十一页，共76页。

α-KTx3亚家族蝎毒肽序列比对BmKTX结构蝎毒肽和Kv1.x钾通道作用模式先导药物多肽ADWX-1的设计第四十二页，共76页。先导药物多肽ADWX-1的设计ADWX-1和BmKTX的序列比对及其和Kv1.3通道作用第四十三页，共76页。ADWX-1和rBmKTX的圆二色谱比较

ADWX-1和BmKTX的NMR结构比较ADWX-1多肽的表达纯化第四十四页，共76页。PeptideChannelsandcellstestedKd-IC50xm(nM)SpecificityIndexxm/cnn=Kv1.3CharybdotoxinhKv1.3TlymphrKv1.1oocyterKv1.2B823.5>999101>1002.9KaliotoxinrKv1.3oocytemKv1.1oocytemKv1.2oocyte0.411.12512.761OSK1[P12,K16,D20]mKv1.3mKv1.1COShKv1.2COS0.0593.18>100154>1000AnuroctoxinhKv1.3TlymphhKv1.1L929hKv1.2COS0.73>1006.11>1008.34ShK(L5)hKv1.3TlymphmKv1.1rKv1.2B820.0767.048192>100ADWX-1mKv1.3HEKmKv1.1HEKhKv1.2HEK0.0020.65>1001>300>100000第四十五页，共76页。ADWX-1与Kv1.3通道作用的机制？设计ADWX-1的丙氨酸扫描突变体测定突变体的药理学活性生物信息学模建复合物结构第四十六页，共76页。ADWX-1的突变体设计ADWX-1突变体二级结构分析第四十七页，共76页。突变体对Kv1.3通道的药理学活性ADWX-1mutantIC50(pM)nIC50(mut)/IC50(wt)Wildtype1.89±0.53131.0R11A336.3±49.18177.9R23A7344.2±395043885.8F24A4013.4±85742123.4K26A967.4±7264511.8T28A58.2±6.5430.8N29A454.4±40.76240.4H33A77.2±37.4340.8T35A28.0±19.2414.8第四十八页，共76页。ADWX-1-Kv1.3复合物结构ADWX-1突变体计算机丙氨酸扫描结果和实验结果的比较ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制

第四十九页，共76页。ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制

在ADWX-1和Kv1.3通道的相互作用中，ADWX-1中的Arg23，Phe24和Lys26是最重要的功能氨基酸残基。Arg23，Lys26和Kv1.3的相互作用Phe24和Kv1.3的相互作用Arg23，Phe24，Lys26和Kv1.3的相互作用第五十页，共76页。有机小分子和多肽调节剂的比较有机小分子correolide与Kv1.3通道的相互作用第五十一页，共76页。多肽KTX与Kv1.3通道的相互作用第五十二页，共76页。Kv1.x通道序列比对、通道模型及药物分子作用区域示意图

小分子和多肽作用Kv1.3通道的示意图

与有机小分子药物相比，多肽调节剂具有更好的选择性和特异性。细胞内小分子多肽钾通道第五十三页，共76页。治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先导药物研发

靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用第五十四页，共76页。靶向钾通道Kv1.3的药物研发疾病动物模型治疗药物药物类型药物有效剂量类风湿性关节炎大鼠PIA模型SL5多肽100ug/kgI-型糖尿病MHCII限制型DP-BB/W大鼠模型PAP-1小分子50mg/kg过敏性皮炎大鼠ACD模型PAP-1/ShK小分子/多肽10mg/kg/16ug/kg多发性硬化症实验性自身免疫脑脊髓炎大鼠模型ShK，ShK-Dap32多肽16ug-80ug/kg第五十五页，共76页。先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用

靶向Kv1.3通道治疗多发性硬化症靶向Kv1.3通道治疗I-型糖尿病靶向Kv1.3通道治疗类风湿性关节炎第五十六页，共76页。靶向Kv1.3通道治疗多发性硬化症

临床病例证实多发性硬化症（MS）病人中经髓鞘质抗原激活的T细胞为特异性表达高数量Kv1.3通道的表型。第五十七页，共76页。MS病人中激活的TEM细胞显著增加，其中TEM细胞高表达Kv1.3通道。第五十八页，共76页。CD8+的效应记忆T细胞激活后也高表达Kv1.3钾通道第五十九页，共76页。Kv1.3通道的阻断剂多肽ShK可选择性抑制MBP特异性的TEM细胞增殖第六十页，共76页。Kv1.3通道阻断剂多肽KTX抑制MBP诱导的T细胞增殖和激活第六十一页，共76页。MS病人的脑组织炎症细胞中特异性高表达Kv1.3通道第六十二页，共76页。MS病人脑脊液细胞（CSF）在体外激活后，迅速转变为TEM细胞；而正常人脑脊液细胞和外周血细胞（PB）激活后维持表型不变。

第六十三页，共76页。Kv1.3通道阻断剂对MS的预防和治疗Kv1.3通道阻断剂多肽KTX、ShK和ShK-L5可有效预防和治疗MS的动物模型:Lewis大鼠的实验性脑脊髓炎（EAE）。ShK-L5s.cShK-L5s.c第六十四页，共76页。靶向Kv1.3通道治疗类风湿性关节炎

Kv1.3通道在类风湿性关节炎（RA）病人的关节滑液细胞中高表达，主要为CCR7-细胞。在关节炎（OA）病人的关节滑液细胞中低表达。第六十五页，共76页。Kv1.3通道阻断剂多肽SL5选择性抑制RA病人关节滑液细胞的增殖和炎症相关细胞因子的产生。第六十六页，共76页。Kv1.3通道阻断剂多肽SL5可显著降低RA动物模型DA鼠PIA模型的临床评分，有效改善病理学症状，但不能显著降低类风湿因子（RF）的含量。第六十七页，共76页。第六十八页，共76页。靶向Kv1.3通道治疗I-型糖尿病

第六十九页，共76页。第七十页，共76页。Kv1.3通道阻断剂多肽SL5和小分子4-AP抑制T1DM病人GAD65-specificTEM细胞的增殖和炎症相关细胞因子的产生。第七十一页，共76页。Kv1.3通道阻断剂小分子PAP-1(Psora-4)的药理学活性第七十二页，共76页。Kv1.3通道阻断剂小分子PAP-1可显著降低T1DM动物模型大鼠EAD模型的发病率，减轻细胞损伤和T细胞引起的炎症。第七十三页，共76页。第七十四页，共76页。总结治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道靶向Kv1.3通道的先导药物研发

有机小分子

多肽靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用

第七十五页，共76页。参考文献BeetonC,WulffH,BarbariaJ,Clot-FaybesseO,PenningtonM,BernardD,etal.SelectiveblockadeofTlymphocyteK+channelsamelioratesexperimentalautoimmuneencephalomyelitis,amodelformultiplesclerosis.ProcNatlAcadSciUSA2001;98:13942-7.BeetonC,PenningtonMW,WulffH,SinghS,NugentD,CrossleyG,etal.TargetingeffectormemoryTcellswithaselectivepeptideinhibitorofKv1.3channelsfortherapyofautoimmunediseases.MolPharmacol2005;67:1369-81.BeetonC,WulffH,StandiferNE,AzamP,MullenKM,PenningtonMW,etal.Kv1.3channelsareatherapeutictargetforTcell-mediatedautoimmunediseases.ProcNatlAcadSciUSA2006;103:17414-9.HanS,YiH,YinSJ,ChenZY,LiuH,CaoZJ,etal.StructuralbasisofapotentpeptideinhibitordesignedforKv1.3channel,atherapeutictargetofautoimmunedisease.JBiolChem2008.Han,S.,Hu,Y.,Zhang,R.,Yi,H.,Wei,J.,Wu,Y.,Cao,Z.,Li,W.andHe,X.,ImKTx88,anovelselectiveKv1.3channelblockerderivedfromthescorpionIsometrusmaculates.Toxicon57:348.Matko,J.,K+channe