用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项

TRIZOL试剂冲洗。假设感到不适，请遵医嘱〔可能的话出示标签。TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。说明：RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚Chomczynski和SacchiRNA一步抽提法。在细胞裂开和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后参加氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相RNADNA和蛋白质也可以用后DNADNARNA产量的正常化有用。〔50-100mg，≥1〕和细胞〔510610〕都有良好的效果。其简洁的操作方法允许同时处理大量样品。整个过程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNANorthernpoly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分别中，建议使用一个内含子中的两个引物。RNA的分别。例如，从鼠肝分别的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNAmRNAhnRNA组成的RNATEA260/A2801.8。RNase的污染：RNase。由于其活性难以RNA时需要留意以下规章。RNARNase的来源。训练良好的微生物学操作方法以避开微生物污染。RNA操作，避开公共用具的RNaseAT1以降低滤〔如移液枪〕RNaseA。RnaseARnaseA得玻璃40.5MNaOH10分钟，再用水充分冲洗，最终高压灭菌。其他留意事项：在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透亮的一次性聚丙烯管。用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。离心前留神地称重平衡。离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。RNA分别技术指南警告：使用TRIZOL时肯定要戴手套和护目镜。避开接触皮肤或衣服。在化学通风橱操作，避开吸入其蒸气。15-30℃。需要但无需补充的试剂：氯仿75%乙醇〔用于焦碳酸二乙酯处理水〕RNase0.5%SDS〔RNaseRnase0.01%(v/v)，静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配〕匀浆化组织1mlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。TRIZOL10%。单层培育细胞化。TRIZOL的参加量取决于培育皿的体积〔10c21mlRNADNA污染。悬浮培育细胞TRIZOL5-10×106个动5-10×1061mlTRIZOL之前先不要洗细胞，由于这会促进RNA的降解。假设需要裂开酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材12023g10分钟从匀浆中除去不容局部。该局部含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将去除过得匀浆液转移到管中，参加氯仿，按前述步骤分别固液相。相分别5分钟，使核蛋白复合体0.2ml152-812023g离心力离心15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。TRIZOL60%。RNA沉淀将水相转到管，假设需要分别DNA或蛋白质的话保存有机相。向RNA1mlTRIZOL0.5ml15-30℃102-812023g10RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。RNA洗涤75%RNA1ml1mlTRIZOL加1ml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-87500g5分钟。再溶解RNA完毕时简洁枯燥RNA沉淀〔空气枯燥或真空枯燥5-10分钟。不要RNARNARNAA260/280比<1.6。加RNase0.5%SDS55-60℃下孵RNASDS〕RNA100%的甲酰胺〔去离子，-7℃保存。RNA分别留意事项：从少量组织〔1-10mg〕或细胞(102-104)样品中分别RNA：向组织或细胞5-10μgDNA4mg/ml时淀粉不会抑制单链合成和PCR。匀浆化之后参加氯仿之前，样品可以存于-60到-70℃至少一月。RNA沉28℃下至少一周或-5到-20℃下至少一年。2600的台式离心机也适用于本试验方案。DNA分别技术指南RNA分别试验所述，完全除去水相之后，存在于相界面和酚相的DNA就DNA8mMDNA，因而它可用于测定DNANorthern〔基于不同来DNA沉淀在使用之前可能还需要进一步的纯化〔如酚抽提。乙醇10%乙醇75%乙醇8mMNaOHDNA沉淀DNA1mlTRIZOL0.3ml无水乙醇，倒置混匀。然后在2023g5DNA。DNA的品质格外重要。DNA洗涤0.1M柠檬15-3030〔周分钟〔周期性混合2-2023g5分钟。DNA0.1M钠乙醇溶液中再洗涤一次。再溶解DNADNA5-15〔不要用离心枯燥，由于那将造〕8mMNaOHDNA0.2-0.3μg/μl。从10750-70mgDNA300-600μl8mMNaOH。建议将DNADNATris缓冲液。8mM的NaOHpH9，DNATEHEPES调整。在该阶段，DNA样品〔尤其是源于组织的〕可能会含有不溶性胶状物质〔细胞膜碎片等。用12023g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至管。8mMNaOHDNA4℃保存过夜；假设需要延长储存时间，DNA4℃或-20℃。DNA的定量和期盼产率8mMNaOHDNAA260DNA的A260A26050μg双链DNA/ml。要计算分析样品的细胞数时，可以假定每个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA、6.5μg、5.8μg。应用：DNA8mMNaOHDNA0.1mMHEPESPCRPCR反响。限制性内切反响：用HEPESDNApH至预定值〔见表3-24小时。在典型的测试试验中，80-90%DNA是可消化的。DNA8mMNaOHpH调整：〔1ml8mMNaOH0.1M1MHEPES的量〕FinalpH0.1MHEPES(μl)FinalpH1MHEPES(μl)8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159DNA分别留意事项：2-8℃保存过夜。2-8℃保存数月。pH7-8EDTA1mM。蛋白质分别技术指南之后的酚-乙醇相〔DNA再沉淀第一步。所WB分析特异性蛋白。异丙醇95%乙醇75%乙醇1%SDS蛋白质沉淀1.5ml15-30℃下存储样品分钟，2-812023g10分钟沉淀蛋白质。蛋白质洗涤31mlTRIZOL2ml洗液。每一轮洗涤时，将蛋白质存于2-875000g5分钟。最终一次洗涤2ml15-30℃下保存乙醇中的蛋白质沉2-875000g5分钟。再溶解蛋白质1%SDS10000g10分钟沉淀全部不WB或在-5到-20℃储存备用。蛋白质分别留意事项：2-8℃下储存1月，在-5到-201年。2-80.1%SDS透析酚-310000g10WB。SDS〔＜0.1BradfordA260/A260的方法〔微量的酚会造成蛋白质浓度结果偏高。常见问题解决：RNA分别期望产率肝、脾，6-10μg1-1.5μg胎盘，1-4μg上皮细胞〔1106培育细胞成纤维细胞，5-7μg低产率样品匀浆化或消化不完全RNA沉淀再溶解不完全3．A260/A280<1.65分光光度分析前将RNA溶于水而，没有溶于TE吸光值上升样品匀浆化试剂的体积太小5分钟水相被酚相污染RNA溶解缺乏4．RNA降解组织从动物体分别后没有马上处理或冷冻RNA样品保存在-5到-20℃，而不是-70到-70℃细胞被胰蛋白酶消化了5．DNA污染样品匀浆化试剂的体积太小〔如乙醇、二甲亚砜、强缓冲溶液或碱性溶液6．糖蛋白或多糖污染RNA中除去这些化合物。1mlTRIZOL0.25ml〔0.8M柠檬酸钠1.2MNaO0.25ml异丙醇。混合、离心，并按前述方案连续。该优化方案可以有效地沉淀RNA，而且可以使多糖和糖蛋白保持可溶状态。从含有大量多糖的植物组织中分别高纯度RNA时，就需要对开头的匀浆液进展改进的离心。DNA分别期望产率肝、肾，3-4μg2-3μg人、大鼠及小鼠培育细胞成纤维细胞，5-7μg低产率样品匀浆化或消化不完全DNA沉淀再溶解不完全3．A260/A280<1.7分光光度分析前将DNA溶于水而，没有溶于TE10%0.1M柠檬酸DNA1次。DNA降解组织从动物体分别后没有马上处理或冷冻RNA样品保存在-5到-20℃，而不是-70到-70℃Polytron或其他高速匀浆器中被匀浆化RNA污染未完全除去水相DNA10%0.1M柠檬酸钠有效洗涤。其他应用PCR扩增之前先将pH8.4用限制性内切酶处理DNA时，先将pH调至预定值，每微克DNA用3-2480-90%DNA都是有效的。蛋白质分别1．低产率蛋白质降解组织从