农药毒理学课件 第二章第五节 消化毒剂的作用机理-Load

ThisWeekinScienceTheFlyintheSoupAnutritionexpertsconvincedthattheflyhasincreasedthenutritionalvalueofthesoupbyaddingvitaminsandproteins.Foodqualityandapleasantenvironmentisbaseduponfeelingandsensations,notonknowledgeofchemicalstructuresanddose-responseextrapolationsorotherexactdata.Reduced–riskpesticidesCriteriaestablishedbyEPA(EnvironmentalProtectionAgency):MusthaveareducedimpactonhumanhealthandverylowmammaliantoxicityMayhavetoxicitylowerthanalternativesMaydisplacechemicalsthatposepotentialhumanhealthconcernsMayreduceeffectsonnontargetorganismsMayexhibitalowerpotentialforcontaminationofgroundwaterMaylowerorentailfewerapplicationsthanalternativesMayhavelowerpestresistancepotential(haveanewmodeofaction)MayhaveahighcompatibilitywithintegratedpestmanagementHasincreasedefficacySevenRoutestoDeathEnzymeinhibitorsDisturbthechemicalsignalsystemsGenerateveryreactivemoleculesthatdestroycellularcomponentsWeakorganicbasesoracidsthatdegradethepHgradientsacrossmembranesDissolveinlipophilicmembranesanddisturbtheirphysicalstructureDisturbtheelectrolyticorosmoticbalanceorthepHStrongelectrophiles,alkalis,acids,oxidants,orreductantsthatdestroytissue,DNA,orproteins第五节消化毒剂的作用机理1996年，吴文君等首次提出了消化毒剂的概念，把主要作用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为消化毒剂。破坏中肠中肠组织破坏剂影响消化酶系消化抑制剂。主要种类：

Bt内毒素植物源次生代谢物，如二氢沉香呋喃类化合物等。两类靶标胃毒剂和消化毒剂一个弱酸在类脂膜两边的分布受胃液与血浆的pH的影响一、Bt内毒素

苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt），产品已达60余种，是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。症状：试虫失去运动能力，不停地颤抖，呕吐，停止取食，死亡。

Bacillusthuringiensis苏云金芽胞杆菌1911年，德国人贝尔奈(Berliner)从德国苏云金省这个地方的一家面粉厂里的地中海粉螟上又重新分离到一种有很强杀虫力的细菌。按照其鞭毛抗原的差异，可将现有分离得到的Bt分成71个血清型，共83个亚种。进入昆虫消化道后，伴孢晶体（主要成分为蛋白质）被昆虫碱性肠液破坏成较小单位的δ-内毒素，使中肠停止蠕动、瘫痪，中肠上皮细胞解离、停食，芽孢则在肠中萌发，经被破坏的肠壁进入血腔，大量繁殖，使害虫得败血症而死，死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。一、Bt内毒素基本作用原理：Bt的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体（原毒素，protoxin）在起作用。杀虫蛋白晶体，是由多个杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalproteins,ICPs）或δ-内毒素（δ-endotoxin）或Cry（晶体）蛋白的亚单位组成。一、Bt内毒素基本作用原理：Bt的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体（原毒素，protoxin）在起作用。昆虫摄食该毒蛋白后，在中肠的高pH环境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解。1.Bt杀虫晶体蛋白（IsecticidalCrystalProteins，ICPs）

杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)所产生的毒素。毒蛋白主要有7种：A2外毒素、B2外毒素、C2外毒素、δ-内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。

δ-内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素(Pretoxin)，经过激活，即消化成分子量为1000～70000的片段，才起毒素作用。完整的毒蛋白一般由三个结构域组成。1.Bt杀虫晶体蛋白（InsecticidalCrystalProteins，ICPs）结构域Ⅰ由一个α-螺旋束组成，可能与细胞膜穿孔有关；1.Bt杀虫晶体蛋白结构域Ⅱ由三组β-折叠片层组成，可能参与了毒素与膜受体蛋白的识别和结合；结构域Ⅲ位于毒素分子C-端，则可能能够防止昆虫肠道蛋白酶对毒性肽分子的进一步降解。

IsecticidalCrystalProteins，ICPs晶体蛋白有130多种，按照杀虫范围和寄主同源型又可分为两大类群，即Cry

蛋白和Cyt蛋白。Cry在活体和离体条件下只对鳞翅目、双翅目或鞘翅目昆虫有效；Cyt活体条件下只对双翅目昆虫有效，而离体条件下具有广谱性。1.Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）Cry分为四大类（根据杀虫谱）：CryI（鳞翅目）、CryII(鳞翅目和双翅目)、CryIII（鞘翅目）CryIV(双翅目)。通常一种毒素只能杀死某一部分易感昆虫，对有益生物和脊椎动物安全。1.Bt杀虫晶体蛋白（ICPs）2.Bt毒素受体蛋白晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子。

①鳞翅目昆虫中肠Bt毒素受体蛋白主要是存在中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV)的氨肽酶N(aminopeptidaseN，APN，肽链端解酶），氨肽酶N催化蛋白氨基末端残基的分裂。

2.Bt毒素受体蛋白晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子。

②烟草天蛾中肠BBMV上Cry1Ab毒素的受体BT-R1，一种类钙粘蛋白(cadherin-like)。③尖音库蚊幼虫中肠中球形芽孢杆菌晶体的Bin毒素受体可能是一种α-葡糖苷酶。

δ-内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入孔洞或离子通道形成等五个环节。昆虫取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素与膜受体结合毒素造成膜穿孔使细胞裂解3.杀虫晶体蛋白的作用机理pH&partofbody?毒素的溶解

晶体蛋白可以溶解于pH>12或pH>9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中.中肠内环境诸如pH值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响δ-内毒素在昆虫体内的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠pH值一般都较高，呈碱性,对δ-内毒素的溶解很有利。3杀虫晶体蛋白的作用机理毒蛋白的活化过程被昆虫取食的晶体蛋白在中肠被溶解碱性环境成熟毒素被中肠蛋白酶消化活化毒素的活化

3杀虫晶体蛋白的作用机理毒素的活化

溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130kD左右的前毒素，打开二硫键，释放出N端的70kD左右的抗酶多肽活力片段。

3杀虫晶体蛋白的作用机理毒素的活化

活力片段至少由两部分组成：毒力片段和细胞结合片段。毒力片段位于N端,由几个保守的亲水区组成，主要结构是α-螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效可能起着重要作用。3杀虫晶体蛋白的作用机理毒素的活化

活力片段至少由两部分组成：毒力片段和细胞结合片段。细胞结合片段由C端的保守区和中间的可变区组成，主要结构是β-片层，负责毒素与靶标昆虫受体的结合，从而决定了毒素的选择性。中肠酶液的组成直接影响到δ-内毒素的降解活化,对δ-内毒素作用的专一性起着重要作用。

3杀虫晶体蛋白的作用机理3杀虫晶体蛋白的作用机理毒素与受体蛋白的结合

毒素被活化以后，毒素首先是通过结构域Ⅱ与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。初始结合(InitialBinding)，结合上的毒素可以再次与受体发生解离，故又称可逆性结合(ReversibleBinding)；3杀虫晶体蛋白的作用机理毒素与受体蛋白的结合

毒素被活化以后，毒素首先是通过结构域Ⅱ与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。不可逆性结合:

初始结合之后，毒素进一步与膜受体蛋白发生紧密结合或直接插入细胞膜,此时的毒素与受体难以发生解离,故为不可逆性结合(IrreversibleBinding)。

插入及孔洞或离子通道的形成

活化的毒素与刷状缘膜上的受体结合后，结构域Ⅰ插入膜内，形成孔洞或离子通道，导致膜完整性的破坏，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡。3杀虫晶体蛋白的作用机理(+)结构域Iα-螺旋束结构域Ⅰ在杀虫蛋白中的作用

Cry蛋白的结构域Ⅰ是由6-7个两亲的α-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成的。3杀虫晶体蛋白的作用机理定点突变结果表明,结构域Ⅰ可能是通过自身的带正电荷残基与带负电荷的膜表面接触。对于结构域Ⅰ在膜上形成穿孔的机制，认为是结构域II在完成毒素-受体识别后，结构域Ⅰ受毒素受体结合的诱导，发生重大构象变化；周围的两亲α-螺旋向外翻，由α-4螺旋与α-5螺旋构成的“轴”突出，4个毒素分子的α-5螺旋相互靠近形成孔道的内壁，而4个α-4螺旋则形成孔道的外壁，孔道穿透整个磷脂双层，细胞外的水大量内流，导致细胞胀裂。

α-5螺旋α-4螺旋α-5螺旋细胞膜α-4螺旋细胞膜Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图H2O3杀虫晶体蛋白的作用机理

结构域Ⅱ由3个β-折叠片层组成，主要进行毒素与受体蛋白的特异性识别。在每个片层的顶端各有一个突环。毒素与受体的作用主要是通过这些突环与受体蛋白识别、并进一步不可逆结合的。突环上氨基酸组成和残基的带电性、侧链大小及疏水性等对毒素与受体的专一性结合都有影响，删除突环或改变突环上残基的性质都会导致毒素与受体结合能力的严重丧失。

结构域IIβ-片层上的突环结构域Ⅱ在毒素-受体结合中的作用3杀虫晶体蛋白的作用机理

结构域Ⅲ在毒素-受体结合中的作用

结构域Ⅲ是由两组反平行的β-折叠片层组成的三明治结构。

①通过交换不同毒素的结构域Ⅲ发现,该结构域对毒素的杀虫专一性有一定影响。②结构域Ⅲ也参与了毒素与受体的结合。

结构域Ⅲ与受体结合及离子通道活性的调节有关。

不同品系的Bt由于产生的Cry蛋白类型不同，不仅杀虫谱不同，而且很可能拥有不同的作用方式。总之，Bt内毒素在进入昆虫中肠后，先是在碱性条件下溶解，然后被活化为小分子多肽,再与中肠内膜上的刷缘状膜小泡（BBMV）中特异受体结合，毒素分子插入质膜形成一个微孔，阳离子和小分子渗入，这些微孔因渗透肿胀而变大，最终细胞破裂。昆虫中肠上皮细胞死亡，肠壁受损，肠道内容物进入血淋巴，直接造成血淋巴pH值上升可使昆虫麻痹死亡；毒性肽进入血淋巴可使昆虫患毒血症死亡；活细胞或孢子进入血腔可使昆虫患败血症死亡。

3杀虫晶体蛋白的作用机理二氢沉香呋喃类化合物：苦皮藤素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等可致粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落；基膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低；内质网极度扩张，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模糊不清楚，双层膜不完整。推测其机理为：此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。

二、其他消化毒剂丁布（氧肟酸类化合物）：可阻碍欧洲玉米螟幼虫和亚洲玉米螟幼虫的发育，使得幼虫体重降低，发育迟缓，蛹重降低，并出现畸形蛹等，并对亚洲玉米螟幼虫具有较强的拒食作用。丁布是一种消化抑制剂，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性而影响食物的消化，进而影响昆虫的生长发育。丁布作用于玉米螟的中肠细胞，使肠壁细胞再生细胞大量分裂，打破了固有的分裂周期，造成局部肿瘤，进而细胞消融。急剧增长的肿瘤细胞消耗大量的能量，而且受损的肠壁细胞不再具备分泌消化酶进行消化和吸收营养物质的功能，因而造成幼虫缺乏营养而死亡。

饥饿对照处理正常对照脱氧鬼臼毒素对菜青虫组织结构的影响浑浊溃烂状肠道内无食物残渣，呈黄色透明鬼臼毒素类化合物CK12h24h72h48h36h组织学观察结果：中肠围食膜逐渐消融，几乎完全消失。对照试虫中肠饥饿试虫中肠处理试虫中肠CK中肠完好,厚度较均匀，细胞间隙小，而处理中肠肠壁细胞逐渐变得浑浊不连续，且中肠细胞松散，细胞间隙拉大，中肠肠壁细胞间的气泡明显增多。这可能是由于脱氧鬼臼毒素作用于试虫的肠壁细胞，肠壁细胞被破坏，肠壁细胞外液得以内渗，导致肠壁细胞肿胀。组织学观察结果处理中肠微绒毛对照中肠微绒毛组织学观察结果：ACBDCKCKTreatCK