新药临床前毒理学评价

新药临床前毒理学评价第1页/共110页Contents目的意义急性毒性试验(acute)长期毒性试验(chronic)特殊毒性试验(遗传、生殖、致癌)其它毒性试验(过敏、刺激etc.)药物非临床研究质量管理规范（GLP）SFDA新药审评会案例学习第2页/共110页AcuteToxicityTest概念、目的意义传统方法基本内容和要求有关问题其它实验方法第3页/共110页Concept动物单次或24h内多次给予受试物后，一定时间内(≥14天)所产生的毒性反应毒理研究早期阶段进行第4页/共110页目的意义(DO

STAR)毒性剂量ToxicDose安全剂量范围Safetymargin

毒性反应Toxicreaction:性质、程度、量毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性寻找毒性反应靶器官TargetOrgan

毒性反应是否可逆Reversibility解毒或解救措施

Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)第5页/共110页目的意义阐明药物毒性作用及强度、计算相对毒性参数了解毒性靶器官为长毒、特殊毒性试验剂量设计为Ⅰ期临床试验起始剂量选择为临床毒副反应监护提供参考其它

(DOSTAR)第6页/共110页OECD口服急性毒性分级等级LD50高毒（VeryToxic)25mg/kg有毒（Toxic)25～200mg/kg有害（Harmful)200～2000mg/kg不分级（Unclassified)2000mg/kg第7页/共110页相对毒性参数

治疗指数TI=LD50/ED50安全系数SF=LD5/ED95可靠或确实安全系数CSF=LD1/ED99安全范围SM=(LD1/ED99-1)X100%SED50/ED50,越大越安全LD5基本无害量ED95基本有效量LD1肯定无害量

ED99肯定有效量第8页/共110页为临床毒副反

应监护提供参考

中毒症状,起始、持续、恢复时间中毒靶器官对抗试验为临床急救提供依据

第9页/共110页为长毒等试验选

择剂量提供依据

长期毒性剂量设计LD50法

(1/10,1/50,1/100)MTD法

(1,1/3,1/10)生殖毒性试验高剂量为母鼠MTD主要药效学剂量限度、一般药理学和药动学剂量设计也要参考急性毒性的LD50第10页/共110页为特殊毒性试验

选择剂量提供依据

致突变试验啮齿类动物微核试验高剂量为1/2LD50果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2LD50和1/4LD50精原细胞染色体畸变试验高剂量=1/2LD50

短期致癌试验高剂量=MTD第11页/共110页I期临床选择起

始剂量提供参考

细胞毒类抗癌药，I期临床起始剂量=1/10LD50第12页/共110页其它系列化合物的合格率分析(除理化性质为主外)也参考LD50复方药物的相互作用,也可通过拆方及合用的LD50来判别相互作用性质比较不同途径的LD50，获得一些生物利用度信息，为剂型开发提供参考第13页/共110页基本原则

执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认第14页/共110页动物获得尽量多信息前提下，使用尽量少动物啮齿类---小鼠或大鼠非啮齿类---犬或猴二种动物(啮齿类及非啮齿类)小鼠18-22g;大鼠120-150g;犬用成年犬初始体重不应超过或低于平均体重的20%♀♂各半

(勤俭办事，服从命令)第15页/共110页受试物工艺稳定、符合临床用质量标准标明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，附质检报告辅料、溶剂、试剂等应标明批号、规格和生产厂家，符合试验要求

第16页/共110页受试物原料药临床拟用剂型复方制剂：复方+拆方(增毒？新毒？)易降解：含降解产物量最高的受试物进行急毒试验，并与临床样品的急毒试验结果比较第17页/共110页给药途径临床拟用途径+原型药物较完全进入循环途径（如静脉注射）啮齿类ig给药前应禁食12h，不禁水第18页/共110页剂量和分组

给药剂量：未见毒性量严重毒性量设空白和/或溶媒（辅料）对照小动物4-6个剂量组,组距0.65-0.85,求LD50大动物可用50%等量递升法(近似致死剂量法),求出ALD和MTD，不必达到致死量第19页/共110页给药容积

不等浓度等容量给药常规及最大给药容量为:动物给药途径给药量小鼠

ig0.2-1.0ml/20giv、ip、sc0.1-0.5ml/20g大鼠

ig1.0-2.0ml/100giv、ip、sc0.5-1.0ml/100g第20页/共110页观察指标及时间药后4h内详观,后每天上下午各一,观察≥14d记录毒性反应、死亡情况,中毒症状、发生时间、持续时间、严重程度、恢复期及动物最短、最长死亡时间其它指标：一般指标、体重变化等第21页/共110页观察

指

征可能涉及的器官、组织、系统

Ⅰ.

鼻孔呼吸阻塞，呼吸频率和深度改变，体表颜色改变A－ECNS，感官，神经肌肉等Ⅱ.运动功能：运动频率和特点的改变A－JCNS，感官，神经肌肉等Ⅲ.惊厥(抽搐)：随意肌明显的无意识收缩或惊厥性收缩A－ECNS,呼吸衰竭,神经肌肉,自主神经Ⅳ.反射A－F感官，神经肌肉Ⅴ.眼检指征A－H自主神经；出血，感染Ⅵ.心血管指征A－E自主神经,CNS,心输出量降低等Ⅶ.唾液分泌A

自主神经Ⅷ.竖毛A自主神经Ⅸ.痛觉丧失A感官，CNSⅩ.肌张力A－B自主神经等Ⅺ.胃肠指征A－B自主神经，胃肠动力等Ⅻ.皮肤A－B刺激性，炎症，过敏等急性毒性研究的一般观察和指征

第22页/共110页病理学检查

大体解剖(濒死动物+死亡动物+存活动物)组织病理学检查:体积、颜色、质地等改变时第23页/共110页结果处理

实验资料用Bliss法计算LD50。必要时求不同性别LD50

表.XXX急性毒性结果及LD50计算剂量对数剂量动物数死亡动物数死亡率机率单位LD50及可信限(mg/kg)(X)(只)(只)%(Y)(mg/kg)第24页/共110页结果处理剂量－反应、时间－反应关系反应可能涉及组织、器官或系统肉眼病变和组织病检，初步判断毒性靶器官病检报告应附：病检者签名+单位盖章+病理照片确定NOAEL、MTD、ALDetc，初步判断受试物的安全范围

第25页/共110页综合评价判断反应与药物作用相关性：时间、发生率、剂量-反应关系动物种属及背景数据病理学检查结果同类药物特点安全范围、毒性严重程度及可恢复性毒性作用靶器官毒性可能涉及部位大体解剖和组织病理学检查结果第26页/共110页注意问题光化学治疗药和辐射增敏剂急毒试验照光+不照光分别测定LD50复方(a+b)中各组分毒性相互作用评价

第27页/共110页注意问题充分重视预试毒理学界对LD50看法试验结果（信息）的一部分LD50测定不足：动物消耗量大获得信息有限测得数值不准第28页/共110页EPAPolicies

DiscouragestheuseoftheClassicalLD50testUsesStructurallyRelatedActivities(SRA)toobviatetheneedfortestingonanimalsRecommendstheLimittest第29页/共110页EPAPoliciesBeyondtheLimit,recommendsapproximatelethaldosetheup-and-downmethods

第30页/共110页近似致死剂量法(非啮齿类动物)6只健康Beagle犬或猴。犬6-12m，猴2-3y估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出剂量序列表

第31页/共110页First第32页/共110页最低致死剂量最高非致死剂量最低致死剂量

最高非致死剂量OR近似致死剂量范围

近似致死剂量范围

Second第33页/共110页MTD法最大允许浓度和最大允许容积仍未测出LD50,可只求MTD值一次或24h多次(总量≤5g/kg)给20只动物观察14d,未见死亡,则MTD＞XXg/kg;

个别死亡,则写成LD50>XXg/kgiv要求pH5-8，速度：大、小鼠10-20sig时空腹,即禁食12-16h左右第34页/共110页常用容量和最大容量(ml)给药途径小鼠20g大鼠200g豚鼠400g家兔1.5kg犬10kgig0.2-1.01.0-4.01.0-5.05.0-10.050-100ip0.2-1.01.0-3.02.0-5.05.0-10.05-15im0.1-0.20.2-0.50.2-0.50.5-1.02-5iv0.2-0.51.0-2.01.0-5.03.0-10.035-50sc0.1-0.50.5-1.00.5-2.01.0-3.03-10第35页/共110页最大无毒性反应剂量（noobservedadverseeffectlevel,NOAEL)

：指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量最大耐受量（maximaltolerancedose，MTD）：

不引起受试动物死亡的最高剂量最小致死剂量（minimallethaldose，MLD）：

引起个别受试动物出现死亡的剂量

半数致死量（medianlethaldose,

LD50）：

在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。第36页/共110页长期毒性试验

Long-termToxicityStudy目的意义基本内容和要求有关问题Mechanic?Innovative?第37页/共110页目的意义(DO

STAR)毒性剂量ToxicDose安全剂量范围Safetymargin

毒性反应Toxicreaction:性质、程度、量毒关系、产生、达峰、持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性寻找毒性反应靶器官TargetOrgan

毒性反应是否可逆Reversibility解毒或解救措施

Antidote确保临床用药安全(重点监测指标)第38页/共110页基本原则

执行GLP整体性具体问题具体分析阶段性随机、对照、重复方法公认第39页/共110页ProcedureAnimalsHousingDrugRouteDosageGroupDurationIndexRecoveryTimeReport（动饲药径剂组周指恢时报告）第40页/共110页Animalinvitro体系筛选实验动物种属或品系理想动物对受试物生物转化与人体相近对受试物敏感已有大量历史对照数据

第41页/共110页Animals

rodentnon-rodentratbeagledogmousemonkey第42页/共110页Animal二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用Beagle犬,必要时用猴、猪等符合等级要求来源、品系、遗传背景清楚，有动物质量合格证大鼠6-9w，Beagle犬6-12m,体重CV≤20％♂♀各半必要时，可用疾病模型动物进行试验Duration≥6m,naturaldeath(rat:1y-15%,1.5y-50%,2y-70-80%)

(勤俭办事，服从命令）第43页/共110页XXX体外代谢种属比较研究代谢产物Area(%)人猴犬大鼠小鼠M0原形84.763.247.686.278.5M1去乙基5.6327.79.877.3516.4M2-1羟基化--0.29M2-2羟基化0.290.468.480.35--结合体内动物药代结果用大鼠和猴进行安评动物选择第44页/共110页XXXX西地那非已上市药枸橼酸钠西地那非改酸根（化4）PDE5抑制剂，治疗男性ED选用雄性动物进行下列试验急性毒性（大鼠、小鼠）安全药理学（小鼠、犬）须与已上市药物进行对比（已上市药需国外进口或买不到时？）动物选择第45页/共110页治疗HER2阳性乳腺癌药物治疗妇女HER2阳性乳腺癌用雌性动物进行一般毒理学研究厂家要求选用雌雄各半动物，何故？动物选择第46页/共110页HousingT,humidity,light,ventilation,animalfeedsRat:≤5/cageor

separated，

acclimation≥1wDog:TBtest,anthelminticacclimation:1-2w/1m第47页/共110页饲养管理主要因素动物类别小鼠、大鼠豚鼠、家兔犬温度(℃)20-2618-2818-28湿度40-70%40-70%40-70%换气次数10-15次/h10-15次/h10-15次/h气流速度13-18cm/s13-18cm/s13-18cm/s压力正压正压负压洁净度100000级100000级落下细菌＜＝3个/皿＜＝3个/皿照明150-300Lux150-300Lux噪声＜60db＜60db臭气氨浓度＜20ppm氨浓度＜20ppm第48页/共110页Drugtestarticle/solvent/excipientname,batchNo.,source,specification,purity,preservecondition,etc

samequalitycriterion

第49页/共110页Route与临床用药途径一致临床iv,大鼠给药＞1月，ip代替im或sc应变换注射部位必要时改变给药途径但应说明原因第50页/共110页模拟临床给药途径纤维蛋白胶：犬腹腔给药小儿止泻贴剂：相当于脐部给药途径方式第51页/共110页DoseandGroup三个给药组,单位：mg(IU)/kg或mg(IU)/m2不等浓度等容量给药低剂量组－高于有效剂量，不出现毒性中剂量组－轻微或中等度毒性高剂量组－明显/严重毒性，或个别动物死亡空白对照－溶媒或赋形剂溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组阳性对照第52页/共110页DoseandGroup大鼠♂♀各15只/组大动物♂♀各≥5只/组第53页/共110页特例：等浓度不等容量给药白蛋白：疗效与蛋白浓度有关紫杉醇脂肪乳：乳剂的比例影响紫杉醇安全性途径方式第54页/共110页Corresponddurationof

clinicalad.withanimalad.clinicalad.durationanimalad.duration＜2w1m2w～1m3m≤3m6

m＞3m6m(rat)9m(dog)duration≥3mad.6dayweekly(Mon.toSat.)第55页/共110页

药物临床疗程啮齿类非啮齿类可支持临床研究阶段

2周~1个月

1个月1个月II期3个月3个月III期（生产）≤3个月3个月3个月II期6个月6个月III期（生产）≤6个月6个月6个月II期6个月9个月III期（生产）＞6个月6个月9个月II期6个月9个月III期（生产）注：表中给药期限均为最短给药期限，不包括恢复期，均为完整试验第56页/共110页Index--ClinicalExaminations

rodentnon-rodentsignsofillhealth+pupil,Tbehavioralchangesbreath,sialosisreactiontotreatmentvomitingDeadormoribundanimal:necropsywithin1h第57页/共110页Index--Hematology

受试物对造血系统有影响，应重视骨髓检查细胞计数RedBloodCell(RBC)血红蛋白Hemoglobin(Hb)红细胞容积Hematocrit(Hct)平均红细胞容积

(MCV)平均红细胞血红蛋白(MCH)平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)网织红细胞计数Reticulocyte白细胞计数及其分类WBC&DC血小板计数Platlet凝血酶原时间ProthrombinTime(PT)第58页/共110页Index--ClinicalChemistry天门冬氨酸氨基转换酶AspartateAminotransferase(AST)丙氨酸氨基转换酶AlanineAminotransferase(ALT)碱性磷酸酶AlkalinePhosphatase(ALP)肌酸磷酸激酶CreatinePhosphokinase(CPK)尿素氮BloodUreaNitrogen（BUN）肌酐Creatinine（Cr）总蛋白TotalProtein（TP）白蛋白Albumin（Alb）血糖Glucose(Glu)总胆红素TotalBilirubin（Tbill）总胆固醇

TotalCholesterol（Tch）甘油三酯Triglyceride(TG)γ-谷氨酰转移酶（非啮齿类动物）γ-GT(non-rodent)钾离子浓度K氯离子浓度Cl钠离子浓度Na第59页/共110页Index--Urinalysis尿液外观Colorandappearance比重SpecificgravitypH

值pHvalue尿糖Glucose尿蛋白Protein尿胆红素Bilirubin尿胆原Urobilinogen酮体Ketones潜血Blood白细胞WBC亚硝酸盐Nitrite镜检*Microscopyofcentrifugeddeposit第60页/共110页Index--Pathology称重并计算系数心脏heart肝脏liver脾脏spleen肺脏lung肾脏kidneys脑brain肾上腺adrenals胸腺thymus睾丸testes附睾epididymides子宫uterus卵巢ovariescalculateorganweightsrelativetobodyweight,pairedorgansweightogether第61页/共110页Index--Pathology病检脏器组织脑（大脑、小脑、脑干）脊髓（颈、胸、腰段）垂体胸腺甲状腺甲状旁腺食管唾液腺胃小肠和大肠肝脏胆囊*肾脏肾上腺脾脏胰腺气管肺第62页/共110页Index--Pathology病检脏器组织主动脉心脏附睾睾丸卵巢子宫前列腺乳腺坐骨神经膀胱眼（发现异常时）*视神经*给药局部骨髓淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）第63页/共110页Index--Pathologyheartliverspleenlungkidneybrainadrenalspancreasstomachduodenumjejunumileumcoloncecum（盲）pituitarythymusspinalcordprostatetestesepididymides

uterusovariesopticnerveinjectionsiteboneandmarrowurinarybladderlymphnodes(mesenteric,local)thyroid¶thyroidlobes第64页/共110页脏器取材样式（SOP)肺脏脑第65页/共110页01

肝脏02030405

肾脏

膀胱

心脏

肺06

脾脏

胸腺07

甲状腺08

气管09

脑垂体10胃切片中组织排列和方向第66页/共110页Index—ECG,Eye大动物长期毒性必须做ECG观察指标：心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和Q-T间期第67页/共110页RecoveryObservation:1/3～1/2animal,2～6wLatetoxicreactionandreversibilityItems:sameastreatmentperiod第68页/共110页测试次数

能反映动态变化一般行为、食量每天观察记录大鼠体重每周一次大动物生理指标每半月一次大动物ECGⅡ导联，给药前、给药期间、停药及恢复期均要检测发现有阳性指标应加大观察密度第69页/共110页ObservationsWesternChineseRecombinant

3～4times≥2timesantibody

≤6m(rat)9m(dog)Toxicreaction:properties,degree,dose-toxicityrelationship,initiatingtime，peaktime,lastedtime,latereactiontoxicity,accumulatingtoxi-city,tolerance

第70页/共110页Frequencyoflab.investigationsrat<=3mrat6mNerimtwicepretreatmentrecoveryendlastad.onceevery1-3mrecoveryendlastad.recoveryend第71页/共110页资料整理首页试验指导者、课题负责人、病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察者SD申明QA申明摘要正文合理的统计图、表有差异的指标应进行统计标示第72页/共110页Problems

PretestAnimal&HousingRouteDoseDurationObservationIndexToxicokinetcsDatahandling

Archives第73页/共110页PretestWhatdependon?Overseaspre-clinical/clinicaldataAcutetoxicity,pharmacodynamicsandpharmacokineticsorintendedclinicaldoseHowlong?2w--1mBiologicalproduct:antibody?第74页/共110页DoseLD50MTDMBSACD3m6m1/10110Cmax50～10030～501/501/35Cmax30～5015～251/1001/10Cmax10～205～10halffordogandmonkey第75页/共110页常用动物等效剂量折算表项目人犬猴兔豚鼠大鼠小鼠成年时体重(kg)70800.02药量折算(mg/kg)4.35.411.0mg/kgmg/m240201212763第76页/共110页Dose高剂量原则上应使动物产生明显毒性低毒性药物高剂量的选择：问题:临床拟用剂量可靠吗？高剂量与临床剂量的比值？与动物有效剂量的比值?办法:是否线性动力学？药物完全吸收了吗？--毒代动力学证据是否达最大给药浓度和体积(限制性因素)?第77页/共110页剂量设计依据充分指导原则文献资料官方资料设计合理药效剂量药代数据种属差异作用机制预试结果第78页/共110页特例：犬的剂量高于大鼠大鼠：10、30、60mg/kg(iv60天)30、60mg/kg给药后尖叫，体重下降胆红素↑，血糖↑，局部刺激犬：25、50、100mg/kg(静滴60天)50、100mg/kg给药后动物流涎、皮肤潮红胆红素↑，血糖↑，局部刺激剂量设计第79页/共110页大鼠雌雄剂量不同雄大鼠：20、60、120mg/kg(ig30天)雌大鼠：10、30、60mg/kg(ig30天)雄大鼠对该药的生物利用度为雌大鼠的一半，故给药剂量加倍剂量设计第80页/共110页分组♂♀分别随机分组开始实验时体重CV≤20％大动物：给药前生理生化指标过高或过低的去掉

第81页/共110页IndexPossibleToxicReactionspharmaco-chemicalpretestingpublishedlogicaleffctsstructureresultsdata第82页/共110页Index-hematology&chemistryReticulocytecountASTALPBUNAlb第83页/共110页Index-pathologyTissue:freeoffathalfrationed：

nochanges(-)0,suspected(±)0.5，mild(+)1，median(++)2，severe(+++)3Localinflammation,WBCinfiltration,localbleeding,haemostasis,suspectedcelldegenerationself-infected,sacrificeinduced第84页/共110页指标增加PEG化EPO（化学1.1）+免疫源性（抗体及其性质）+免疫毒性[细胞及体液免疫：IgG、IgM、C3、C4、CIC、T淋巴细胞分型（CD4+、CD8+)，IL-6,INF-γ等）]指标检测第85页/共110页测试方法简便快速灵敏准确公认第86页/共110页Toxicokinetics毒性剂量系统暴露的代谢动力学可以描述系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间关系目的在于解释长期毒性试验结果第87页/共110页Toxicokinetics合适采样点，获得AUC、Cmax、Tmax等参数结合药物血浆蛋白结合率评价系统暴露量长毒试验各剂量全部或部分动物，以估算高剂量药物的动力学过程是否属非线性鼓励创新药物进行毒代动力学研究

第88页/共110页DataHandlingRationdata:x±s,internationalunitvscontrolanddosagegroup,vsd0Statistics:ttestorFtest，Riditanalysis第89页/共110页资料整理rawdata,documentation,records,protocol(andamendmentsthereto)specimens,reservesamplescontrolarticlefinalreport(signed)原始资料应保存完好，我国规定原始资料至少保存至生产后5年第90页/共110页均值和单个数据Rodent：组均值>单个动物，背景数据和文献数据可参考Non-rodent：数量少、个体差异大，单个动物的试验数据具有重要毒理学意义。须与给药前、对照组和背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限第91页/共110页统计学意义和生物学意义有统计学意义并不一定有生物学意义判断因素数据变化剂量－反应关系其他相关参数改变与历史背景数据比较异常数据合理解释

第92页/共110页正确判断毒性反应给药组和对照组之间差异来源与受试物有关的毒性反应动物对药物适应性改变正常生理波动判断关注剂量－反应关系参数变化幅度和性别差异分析毒理学变化参数关联和机制单个参数变化判断应慎重结合TK第93页/共110页毒性反应对于临床试验意义种属差异无关毒性：高剂量，非线性动力学代谢特异反应难以检测：头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊疑毒从有第94页/共110页机制研究（探索药理/毒理信号通路）鉴别新分子实体是否有新的药理/毒理作用机制，加深对药物的认识与已有类似药物作用比较，判断是否属于新作用机制采用多种先进的生理、生化和分子生物学方法和技术对机制进行多层次研究例：1971年美国颁布《国家癌症法》以来，前列腺癌、肝癌、胰腺癌等发病率和/或死亡率没有明显改变第95页/共110页Pfizer研发CETP抑制剂损失8亿$第96页/共110页Torcetrapib的副作用源自脱靶效应辉瑞公司ILLUMINATE试验详细数据表明torcetrapib提高死亡率可能源于其脱靶效应动物研究发现切除肾上腺，可以阻断torcetrapib的升压效应，验证了醛固酮所起的作用美国转化医学协会的主席BruceLittman指出，torcetrapib事件另一个教训是，当涉及到黑箱机制时，尤其是与安全性有关的问题时，一定不要把所观察到的问题仅仅作为风险那么简单NatRevDrugDiscovVOL10|MAR2011|163第97页/共110页2011年立普