芍药苷治疗肠易激综合征的药效学研究

[在此处键入]目录中文摘要 前言白芍，是毛茛科白芍属植物芍药（PaenoiaLactifloraPall.）的去外皮干燥根ADDINNE.Ref.{1DC08E15-2832-4824-AF6F-A23940A28349}[1]，药材主产地为浙江、四川等地。在中国的传统中药方剂，如桂枝汤ADDINNE.Ref.{4A45DBA3-2A45-4E08-9C03-2CD2AA14799C}[2]、四物汤ADDINNE.Ref.{F5D52BA6-8C53-4B1F-9AF1-BEF39AE1CB5C}[3]、芍药甘草附子汤ADDINNE.Ref.{6E9AB5E1-4671-496E-9FDD-22C5F089B7C5}[4]等是一味重要的成分，可以用于治疗如头痛、盗汗等，发挥不同的治疗作用。最早于1963年从芍药根提取获得了芍药苷（paeoniflorin，PF），经过对化学成分的深入研究，。先后分离纯化出了几个以芍药冠名的苷类化合物（内酯苷、羟基、总苷等）ADDINNE.Ref.{49732192-D8F2-402F-BDC3-37050191003D}[5]。肠易激综合征（Irritablebowelsyndrome，IBS）是消化系统慢性功能性胃肠疾病，主要临床症状表现为排便或叛变习惯的改变，并伴有腹痛或腹泻ADDINNE.Ref.{5487AA44-16EB-464C-B7C4-E856E8A17E83}[6]。按照大便的性状我们将肠易激综合征分为以下四种临床类型：便秘型、腹泻型、混合型以及不定型[7]。肠易激综合征患者的主要症状为伴随性腹痛，以及腹泻。并且，腹痛和腹泻的发生频率和严重程度，对于肠易激综合征的患者有明显的影响。目前，IBS的发生机制目前尚未完全明确ADDINNE.Ref.{4FDE56DF-D3F1-4559-9FBD-238306CC5139}[8-11]。对于肠易激综合征可能的发病机制，如：胃肠道动力异常[12]、内脏感觉异常[13]。此外，肠道炎症的变化，免疫功能的变化[14]也是IBS可能的发生机制。营养规律的饮食、生活方式改变及非感染性炎症等被认为是潜在的致病因素。越来越多的证据显示，肠道内环境紊乱造成的肠蠕动异常、肠道非感染性炎症以及肠黏膜屏障功能改变在IBS发生过程中起到重要作用。目前临床IBS治疗是以对症治疗为主，提高病人生活治疗的对症治疗ADDINNE.Ref.{B3C75B82-FC6D-4BB0-8A24-1899EDFAE2DA}[15]。腹泻型用5-HT3受体拮抗剂，便秘型采用5-HT4受体激动剂，腹痛治疗采用解痉剂或抗胆碱药，以及微生态制剂ADDINNE.Ref.{F3741191-B6E3-418A-8F80-CAF3779FA034}[16]。研究证明，中医治疗辨证施治IBS的方剂中多数均含有白芍ADDINNE.Ref.{1483A635-E5D0-4288-B13C-35EE20001A18}[17]。经典的传统中药复方“痛泻要方”能有效缓解腹痛、腹泻，临床上被广泛用于IBS治疗ADDINNE.Ref.{66B9E06C-DBF4-4D6E-9DAD-40F06A2F9782}[18]。作为痛泻要方中的“君药”成分，白芍在内脏痛的治疗中发挥主要药理学效用，其主要活性成分为芍药苷所占比例最大约占70%以上，可能起到主要的作用ADDINNE.Ref.{028B998E-754B-4872-B5C3-17AD05A1D6BF}[19]。实验也显示，芍药苷能够显著缓解慢性炎症，调节肠蠕动，改善肠黏膜功能，维持肠道内环境稳态，进而达到缓解IBS症状的目的。内脏高敏感性同样被认为是引发IBS的重要原因ADDINNE.Ref.{F87A148C-01B7-4090-8C2C-34AC323FDA13}[20]。大量研究业已确证芍药苷具有显著的镇痛作用ADDINNE.Ref.{49C67A81-48DA-4FA1-848B-F018D1032AAE}[21]。近期研究指出,芍药苷可作用于大鼠中枢系统κ-阿片样受体以及α2-肾上腺素能受体，从而改善大鼠内脏高敏感性，显著缓解内脏痛ADDINNE.Ref.{13E9A638-3979-4301-BCBA-035A508CB881}[22]。因此，有学者认为，芍药苷有可能成为IBS的潜在治疗药物。同时芍药苷还有具有其它广泛的药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、降血糖、免疫调节等ADDINNE.Ref.{96C9D0B8-CE9C-4857-86B5-267FE4F01DCA}[23]。然而，目前可获得的文献中，未见有关芍药苷改善胃肠道症状的直接药效学证据。为了进一步明确芍药苷治疗IBS的效果及其作用机制，实验通过束缚应激大鼠，建立了大鼠的腹泻模型；通过给小鼠注射新斯的明，建立了小鼠的腹痛模型，并以这两个模型来验证肠易激综合征能否被芍药苷所缓解。基于整体实验动物的研究结果，考虑使用人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞模型，探索ZO-1蛋白的表达ADDINNE.Ref.{36DCC0B5-4561-44E9-B0AF-B0158991545C}[24]和NF-κB信号通路ADDINNE.Ref.{9CF83D36-64C8-4440-8793-60C768E352BD}[25]，对芍药苷缓解腹痛腹泻症状和炎症反应的分子机制进行初步探索。第一章芍药苷治疗肠易激综合征的药效学研究 芍药苷是单萜糖苷类化合物，是中药芍药中的主有效成分。实验显示，芍药苷能够显著缓解慢性炎症，调节肠蠕动，改善肠黏膜功能，维持肠道内环境稳态，进而达到缓解IBS症状的目的。因此，我们通过束缚应激实验来建立大鼠的腹泻模型，以及注射新斯的明的方法建立小鼠的腹痛模型，来探究芍药苷对于肠易激综合征的调节作用。1.材料1.1仪器2D5-2A型低速离心机；3K15通用台式冷冻离心机（美国Sigma公司）；1-100μL、1-200μL、1-1000μL移液器（德国Brand公司）；Vortex—Genie2旋涡混合器（美国SI公司）；KQ-100E型超声清洗器(昆山超声仪器公司)；普通天平（上海宇恒平仪器有限公司）；水浴箱。1.2药品与试剂芍药苷（纯度≥98%），批号：160525，北京欧纳尔生物工程技术有限公司；马来酸曲美布汀片，浙江昂利康制药有限公司；匹维溴铵片，Abbott，ProductsSAS公司；盐酸洛哌丁胺胶囊，西安杨森制药；甲硫酸新斯的明注射液，上海信宜金朱制药有限公司，国药准字：31022770；碳沫，北京莱盛高新技术有限公司;生理盐水，石家庄四药有限公司；乙醚，天津市化学试剂供销公司；超纯水；羧甲基纤维素（化学纯），国药集团化学试剂有限公司。1.3实验动物本校实验动物部提供SqragueDawley大鼠，并且雌雄各半，体重均在220g-205g左右，实验动物合格证号：SCXK（京）2012—0001。本校实验动物部提供雌雄等量的ICR小鼠，体重均在16g—20g左右，实验动物合格证号：SCXK（京）2012—0001。实验所需动物均于首都医科大学实验动物部—动物房饲养，24小时昼夜规律、自由饮水、自由进食，室温控制在20℃—22℃。动物饲养一周以便适应环境。动物实验经过首都医科大学动物伦理委员会批准。2.实验方法2.1大鼠腹泻模型的建立与药物治疗实验药物的配制方法：芍药苷大剂量组（56mg/kg）：用分析天平称量1.96g芍药苷纯品，溶于350mL0.9%NaCl注射液中；芍药苷中剂量组（28mg/kg）：用分析天平称量0.98g芍药苷纯品，溶于350mL0.9%NaCl注射液中；芍药苷小剂量组（14mg/kg）：用分析天平称量0.49g芍药苷纯品，溶于350mL0.9%NaCl注射液中。IBS大鼠腹泻模型阳性药盐酸洛哌丁胺（1.7mg/kg）：取28粒阳性药胶囊，并将其中所有药物粉末溶于329.41mL0.9%NaCl注射液中；阳性药马来酸曲美布汀(6.25mg/kg)：取3片阳性药马来酸曲美布汀研磨粉末溶于480mL0.9%NaCl注射液中。分组、灌药：SD以随机法分成8组，具体每组雌雄数量对等各5只。实验组名称为：CK组、芍药苷给药组（灌胃），给药量为26mg/kg、肠易激综合征腹泻模型组、阳性药盐酸洛哌丁胺胶囊组（1.7mg/kg）、阳性药马来酸曲美布汀片组（6.25mg/kg）、以及芍药苷高剂量组（56mg/kg）、芍药苷中剂量组（28mg/kg）、芍药苷低剂量组（14mg/kg）。除正常对照组动物给予0.1mL/10g生理盐水进行灌胃之外，其余各组给予大鼠相应的药物灌胃，每天需要灌胃两次，每两次之间间隔8小时分别为每天上午八点回来下午四点，进行灌胃，连续给药7天。束缚应激刺激方法诱发大鼠腹泻：给药第六天晚开始，禁食12小时。末次给药半个小时后，大鼠乙醚麻醉后，使用透明胶带将大鼠的前肩、胸部、以及前上肢进行束缚、固定。并不限制取活动，但防止其用上肢抓头面部。将直径3毫米的玻璃珠置于大鼠直肠离其肛门3厘米左右的位置。后将其放至清洁盒内。待其醒转，再把它置于正常体位。计时1小时，记录在1小时内，大鼠排便排出的粪便点数以及大鼠直肠内的玻璃小球从直肠排出的时间。排便次数增加或排便时间缩短即为模型建立成功ADDINNE.Ref.{5189F155-9C3B-4EA2-A272-82976903CAD1}[26]。2.2小鼠腹痛模型的建立与药物治疗受试药物的配制方法：芍药苷大剂量组（80mg/kg）：用分析天平称量0.24g芍药苷纯品，溶于60mL0.9%NaCl注射液中；芍药苷中剂量组（40mg/kg）:用分析天平称量0.12g芍药苷纯品，溶于60mL0.9%NaCl注射液中；芍药苷小剂量组（20mg/kg）：用分析天平称量0.06g芍药苷纯品，溶于60mL0.9%NaCl注射液中。IBS小鼠腹痛模型阳性药盐酸洛哌丁胺（2.4mg/kg）：取6粒阳性药胶囊（2mg/粒），并将其中所有药物粉末溶于100mL0.9%NaCl注射液中；阳性药匹维溴铵片（45.05mg/kg）：取4片匹维溴安片（50mg/片），用研钵碾碎成粉末溶于88.8mL0.9%NaCl注射液中。按0.2mL/10g，一天分二次进行灌胃，共7天。IBS小鼠造模所需溶液的配置：新斯的明溶液：配置浓度为0.03mg/mL新斯的明生理盐水溶液，给药体积为0.1mL/20g。碳沫糊剂：于2%的羧甲基纤维素中混悬入5%碳沫，给药体积为0.2mL/10g。实验动物分组及给药：将实验小鼠随机分为8组，每一组数量为10只，雄雌各半。分别为：正常对照组、正常小鼠芍药苷给药组（80mg/kg）、IBS腹痛模型组、阳性药盐酸洛哌丁胺组（2.4mg/kg）、阳性药匹维溴铵片组（45.05mg/kg）、芍药苷低剂量组（20mg/kg）、芍药苷中剂量组（40mg/kg）、芍药苷高剂量组（80mg/kg）。正常对照组动物按0.2mL/10g给予生理盐水灌胃，其余各组给予相应药物灌胃，每天灌胃2次，每次间隔8小时，连续给药灌胃7天。通过采用小鼠皮下注射新斯的明的方法，制备小鼠IBS腹泻模型。并使用碳沫糊剂分别灌胃，观察计算小肠碳沫的推进长度和推进率的改变。如果推进长度和推进率指标升高，即为模型建立成功ADDINNE.Ref.{D72F63E9-43F7-41B0-81E8-5D14DACBC8B7}[27]。给药灌胃第6天晚，对小鼠进行禁食12小时，并与末次给药灌胃30分钟后，正常对照组皮下注射生理盐水、正常小鼠芍药苷给药组皮下注射生理盐水。IBS腹痛模型组皮下注射盐酸新斯的明溶液、阳性药组皮下注射盐酸新斯的明溶液、芍药苷高中低剂量组皮下注射盐酸新斯的明溶液，生理盐水与盐酸新斯的明溶液等体积。造成小鼠小肠痉挛。15分钟后各组均灌胃给予碳沫糊剂，体积0.2mL/10g，20分钟后颈椎脱臼处死，将从幽门直至结肠起点的小肠组织进行分离，并分别进行小肠碳沫推进长度的测量，以及小肠总长度的测量。从而进行碳沫推进百分率的计算。推进距离为：从幽门起始至小肠碳沫行进终点的推进长度，并计算小肠碳沫推进推进率（%）=推进长度÷小肠总长度×100%。3.结果3.1芍药苷改善大鼠腹泻症状芍药苷对正常大鼠的肠蠕动无显著影响。如表1-1所示，与正常对照组相比，模型组大鼠的排便粒数显著增多（P<0.01），排出时间显著降低（P<0.01），排出玻璃珠时间由30.16±11.13min缩短至12.40±4.12min；与模型组比较，芍药苷的28和56mg/kg/d剂量受试药组对大鼠肠易激综合征腹泄症状均有显著的抑制作用（P<0.05，P<0.01）。3.2芍药苷治疗小鼠腹痛症状芍药苷对正常小鼠的肠蠕动无显著影响。如表1-2所示，与正常对照组相比，模型组小鼠的碳沫推进距离和推进率显著增加（P<0.01），由至23.90±5.36cm增加至33.25±4.97cm，结果显示，小鼠腹痛模型造模成功。与模型组比较，受试药芍药苷的14、28和56mg/kg剂量组均能显著缩短小鼠的肠道碳沫推进距离（P<0.05,P<0.01），改善小鼠的腹痛症状。4.讨论肠易激综合征是临床上一种复杂的症候群，属于肠道功能性疾病，其病因复杂。在研究中，构建IBS动物模型ADDINNE.Ref.{1BCC1F61-093A-4BEF-BA71-988F764FA10E}[28]的方法包括应激法、肠道机械刺激、灌胃刺激、腹腔内注射、脑内注射内源性CRF（corticotropin-releasingfactor，促肾上腺皮质激素释放因子）ADDINNE.Ref.{2B2D149A-4D81-4258-899C-62707A9410CB}[29]等方法。复合刺激的方法是比较贴近发病机理的模型构建方式ADDINNE.Ref.{2F10E322-BF5F-4EC0-A59B-ACBA3B84B501}[30]。本章中，对芍药苷进行大鼠束缚应激和药物刺激复合因素致肠易激综合症腹泻和腹痛模型实验，明确药物剂量对稀便级数和稀便次数的改善作用。本次实验中针对IBS出现的腹痛和腹泻症状，分别设计了对应的模型进行验证。在大鼠IBS腹泻模型中，芍药苷中剂量、芍药苷高剂量组对大鼠肠易激综合征腹泄症状均有显著的抑制作用。在小鼠的腹泻模型中，芍药苷的三个剂量组均能显著缩短小鼠的肠道碳沫推进距离，改善小鼠的腹痛症状。同时，在腹痛和腹泻模型组中，中剂量组均出现了较好的疗效，提示进行后期实验可以参考中剂量组剂量。由于在临床实践过程中，口服是中药最为常用的给药方式，且胃肠道症状是IBS患者的主诉症状。因此，本研究采用口服灌胃给药，且重点关注芍药苷对胃肠道和肠上皮细胞的影响。建立动物腹痛模型的主要障碍是如何对动物疼痛等级进行评估和测量。肌电图是一种常见的用于表征腹部肌肉收缩的技术，该方法可评估动物对结直肠扩张（CRD）的反应。但基于CRD的腹痛模型是侵入性的，技术上具有挑战性且耗时。新斯的明注射法是广为认可的腹痛模型构建方法ADDINNE.Ref.{01C31C34-FF46-44DD-BEAA-E7A5BE9B1D25}[31]，与其他方法相比，其侵入性最小、对动物造成的伤害少且易于构建。在腹痛模型中，小鼠的使用比大鼠更为常见，这是由于多种小鼠转基因品系的发展使其更具有学术影响力。研究使用肠蠕动异常大鼠为模型以评估芍药苷的抗腹泻药效。番泻叶灌服和四肢束缚等方法都可引发大鼠肠蠕动异常ADDINNE.Ref.{518D05E6-97D7-4B0F-8485-F4F5F087C11C}[32]，为了避免药物相互，同时更贴切的模拟应激性腹泻症状ADDINNE.Ref.{4B25F14D-CCCE-4D6D-BA2B-65E7D0A7F475}[33]，本实验采用四肢束缚法构建大鼠腹泻模型。上述基于整体实验动物的研究发现，芍药苷可显著缓解IBS的腹痛腹泻症状。作为芍药总苷的成分之一，芍药苷在动物实验中表现出良好的抗腹痛和腹泻的疗效，提示我们总苷的其它成分也可能有较好的疗效。通过对天然产物结构的对比和改造，为后续开发新药提供借鉴。第二章芍药苷对肠上皮细胞膜屏障的保护作用及机制探讨保证肠上皮细胞屏障的完整性是中药复方的可能机制之一。本章在成功建立Caco-2细胞屏障模型基础上，尝试用胰蛋白酶刺激的方法建立Caco-2细胞屏障功能紊乱模型，探讨芍药苷对肠上皮Caco-2细胞屏障功能的保护作用，以及可能的分子机制。通过细胞水平的研究，确证芍药苷治疗IBS的药效。1.材料1.1仪器Sartorius—PB—10型PH计（赛多利斯（中国）有限公司）；150—i型二氧化碳培养箱（美国Thermo—Scientific公司）；D5-2A型低速离心机（美国Sigma公司）；转印槽（美国Bio-Rad公司）；KQ-100E型医用超声清洗器（昆山市超声仪器厂）；Eppendorf-Research-plus型可调量程移液器（德国Eppendorf（中国）有限公司）；164-5050—Bio-Rad型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Sartorius—ME—235—S型千分之一电子天平（北京赛利斯科学仪器有限公司）；普通电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；Coster—25cm2细胞培养瓶；Vortex-Genie—2型旋涡混合器（美国ScientificIndustries有限公司）；DZF—6030—B型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；IKA-RCT-basic磁力搅拌器（IKA中国有限公司）；ElipseTi-U型倒置显微镜（日本尼康公司）；Corning-12孔塑料细胞培养板；孔径0.4μm的CorningTranswell细胞培养插件；细胞电阻仪（Electricalresistancesystem，ERS，美国MILLIPORE公司）；多用途旋转摇床（上海莱波卫有限公司）；DL-CJ-2N型超净工作台（哈尔滨东联公司）；水浴锅（IKA中国有限公司）；OMNIBeadRuptor24珠式研磨均质器（美国OMNI公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；-80℃超低温冰箱（Thermo（德国）公司）；3K15型通用台式冷冻离心机（美国Sigma公司）；全能型凝胶成像分析机ChemiDocMP(Bio-Rad,USA)；Sigma—3K—15型台式高速冷冻离心机（美国Sigma-Technology有限公司）。1.2药品和试剂硼替佐米，Bortezomib，CAS号为179324-67-7，分子量为384.23700，货号：SJ003ED611952；荧光素钠，CAS号为518-47-8（购自SIGMA-ALDRICH）经验分子式（希尔表示法）：C20H10Na2O5，分子量376.27，物理状态为粉末，溶解性为H2O：1mg/mL产品编号F6377-100g；芍药苷（纯度≥98%），批号：160525，北京欧纳尔工程生物技术有限公司；PBS（phosphatebufferedsaline）Tablets，100mL，Code：E404-200TABS，Lot#1512C105，购自Amersco公司；DMEM培养基（高糖型），Cornin公司；ZO-1抗体，美国Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），Sera—Pro公司；青霉素链霉素混合液（p/s），Gibco公司；全蛋白提取试剂盒，泰科兰博生物（北京）技术有限公司；0.25%胰酶—EDTA（Trypsin-EDTA），美国Gibco公司；碱性磷酸酶检测试剂盒，北京碧云天技术生物有限公司；去离子水；荧光素钠，西格玛奥德里奇中国公司；哺乳动物细胞提取试剂盒，美国Bio—vision公司；丙烯酰胺，美国Sigma-Aldrich公司；GAPDH抗体，英国Abcam公司；1.5MTris-ClPH8.8，北京普利来基因技术有限公司；1.0MTris-ClPH6.8，北京普利莱基因技术有限公司；甘氨酸（Glycine），索来宝公司；Tris-（hydroxymethyl）-aminomethane，美国Sigma-aldrich公司；甘氨酸，美国Affymetrix公司；SDS溶液，北京普利莱技术有限公司；NP-40，Beyotime，北京博然一新科技有限公司；脱脂奶粉，北京普利来技术公司；Triton-X-100，北京华夏远洋科技有限公司，Toyobo；SDS蛋白上样缓冲液（5X）（50%甘油），上海碧云天生物公司；甲叉丙烯酰胺，Sigma，泰克兰博生物技术有限公司；溴酚蓝，泰科兰博生物技术有限公司，Sigma；过硫酸铵（APS），Sigma，泰科兰博生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺），美国USB公司；N，N，N’，N’—四甲基乙二胺（tetra-methyl-ethylenediamine，TEMED），美国Amersco公司；标准蛋白Marker，美国Fermentas公司；PVDF膜，美国MILLI-PORE公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris-Base），美国Affymetrix公司；Western-Bolt-luminal-AB显色液，美国Thermo公司；Ruler-Prestained-Protein-Ladder，26616，美国Thermo公司；苯甲基磺酰氟（PMSF），上海碧云天生物技术有限公司；磷酸酶抑制剂（PHOSSTOP），上海罗氏制药有限公司；甲醇，分析纯，北京化工厂；氯化钠，分析纯，北京化工厂；高效Ripa裂解液，北京索来宝科技有限公司；吐温20，上海麦克林生化科技有限公司；Super-Signal-West-Pico-Plus-Chemiluminescent-Substrate，美国Thermo公司；蛋白上样缓冲液，北京普利莱基因技术有限公司；膜再生液、血清蛋白V皆购置于北京索莱宝，HRP，英国abcam公司；GoatAnti-MouseIgG-HRP，美国Santa-Cruz公司。1.3实验动物和细胞株SpragueDawley（SD）大鼠，雄性，体重220~250g左右，由本校实验动物部供给，证号：SCXK（京）2012-0001。Caco-2细胞，（第30代），来源于北京协和医学院基础医学研究所协和细胞中心。2.实验方法2.1Caco-2细胞正常屏障模型的构建由于Caco-2细胞与药物的体内吸收具有良好的相关性，所以目前Caco-2细胞常常作为体外肠吸收研究较为理想的主要研究工具，已引起国内外研究者的广泛重视。我们从国家实验细胞资源共享平台购买Caco-2细胞，在实验室建立单层细胞模型，开展相关工作：1、通过光镜和电镜进行形态学评价，2、上皮细胞跨膜电阻（TEER）测定，3、比较膜内外ALP活性，4、标记物于单层模型中的转运参数，由以上参数进行Caco-2细胞单层的可靠性评价ADDINNE.Ref.{FCEF4C2A-EFE3-427C-9CDC-E371987267B8}[34]。结果表明，在外观形态方面其是完整的。TEER随细胞的生产而显著增大。在膜内侧和外侧的培养基中，碱性磷酸酶（ALP）的活性差异，增大趋势明显。并可以预见细胞旁的表观渗透参数（PApp）、跨细胞转运标记物的表观渗透参数（Papp），有高低变化。以上结果表明，本实验中我们建立的Caco-2细胞模型均已达到胃肠吸收化合物机制研究所要求的细胞极性、细胞通透性、细胞完整性、P-gp表达水平。2.1.1Caco-2细胞的培养、传代、冻存PBS缓冲溶液，现用现配。即用型（不含钙和镁）片剂装，只需溶解于水中即可（1片/100mL）；PH7.2-7.4。或者于双蒸水900ml中溶入NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，PH值用盐酸调至7.4，加水，定容至1L。将瓶口半拧开，包上牛皮纸，在高压蒸汽锅中消毒，然后拿到超净台中方可打开，用完用封口膜将口封好，放置于4℃保存备用。将2017.2.22复苏外购协和基础所细胞F30代，使用含15%FBS、1%双抗的DMEM培养基，与37℃5%二氧化碳中培育，每24小时换一次溶液，每次换液皆需要用37℃PBS先将整体洗干净。待细胞汇合度达到80%时，细胞位于对数期时，进行传代。传代时，需进行一下步骤：1、倒去培养液，2、以37℃PBS洗两遍，3、以0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，时间8min。4、观察细胞改变，至其边缘有变圆迹象时，停止消化，吸去消化液。，并加入适量完全DMEM培养液，用吹打管轻轻吹打成均匀细胞悬液后接种于3个新的25cm2细胞培养瓶中，用倒置显微镜观察生长于培养瓶中8天的Caco-2细胞，可观察到细胞呈单层紧密连接状态。细胞冻存：将Caco-2细胞按照以上方法消化。并按照胎牛血清：DMSO=9:1的比例，将新配置的细胞冻存液加入其中。之后，将细胞密度调整为：5-6×106个/mL。吹打混匀后每1mL加入到细胞冻存管中，封口。放入4℃冰箱降温1h，-20℃冰箱中放置20min，-80℃冰箱，过夜。保存于液氮罐中。2.1.2Caco-2细胞生长曲线将34代Caco-2细胞，接种于12孔板中培养，细胞密度为：1×105个/mL。前一周隔天换液体，一周之后每天换液。每两天选取2孔细胞开展消化和计数实验，开展11次这项工作，最后一次间隔时间为一天。已获得的数据进行正常曲线绘制，横坐标生长时间，纵坐标细胞密度，具体如下图（2-1）所示图2-图2-1Caco-2生长曲线（0-21days）

Fig.2-1Caco-2growthcurve(0-21days)同时记录了24天细胞生长情况。见图2-2（光镜下连续观察Caco2细胞（10×））可以发现14天后细胞长满，连接致密，形成致密的细胞层。细胞生长第2天细胞生长第2天细胞生长第4天细胞生长第6天细胞生长第8天细胞生长第10天细胞生长第12天细胞生长第14天细胞生长第16天细胞生长第18天细胞生长第20天细胞生长第22天细胞生长第24天图2-2光镜下连续观察Caco2细胞（10×）Fig.2-2ContinuousobservationunderlightmicroscopeCaco-2cell(10x)2.1.3Caco-2细胞单层模型鉴定Caco-2细胞与分化的小肠上皮细胞，在结构与功能上相类似，在细胞培养条件下，可形成连续的细胞单层。在透射电镜下，可以观察到Caco-2细胞形态，具有微绒毛结构，见图2-3。因此，我们可以从以下三个方面：一，细胞单层的完整性，如：跨膜电阻（TEER）、紧密连接蛋白（ZO-1）；二，细胞极性的形成，如：碱性磷酸酶（ALP）；三，细胞单层的通透性，如：荧光黄；来进行药物对于Caco-2细胞模型影响的验证和评估。图2-图2-3透射电镜下Caco-2细胞形态

Fig.2-3MorphologyofCaco-2cellsundertransmissionelectronmicroscope跨膜电阻TEER值的测定：将处于对数生长期的Caco-2细胞消化，用新鲜配制的DMEM培养基，重悬，配置成细胞密度为1×105个/mL，并接种于孔径为0.4μm、有效膜面积为4.5cm2的12孔细胞培养板（Transwell）上，将0.4mL细胞悬液接种于多聚碳酸脂膜12孔Transwell细胞插件的AP侧。在接受池中加入1mL完全DMEM培养基，将其置于细胞培养箱中培养21天，前一周隔天换液体，一周之后每天换液。同时从细胞接种的第二天起每天用细胞电阻仪测量单层细胞的跨膜电阻TEER值，约14－21天后，形成紧密的单层细胞，其细胞的TEER值现在升高，这表明其形成了细胞屏障ADDINNE.Ref.{64BE1FC8-82FD-4448-B937-6594EB306A51}[35]。TEER值和时间的关系如图2-4。图2-图2-4Caco-2电阻值变化

Fig.2-4Caco-2resistancechange碱性磷酸酶的测定：碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase）是Caco-2细胞的极化标志酶之一，主要表达于刷状缘。本实验通过使用碱性磷酸酶试剂盒，检测出的Caco-2细胞单层顶侧以及底侧的培养液中碱性磷酸酶所表现出的差异性，以此来确定细胞极性的形成。按照碱性磷酸酶试剂盒的检测步骤：①将所需试剂从-20℃的冰箱取出，静置于室温下，解冻，待用。②配置显色底物溶液：分别抽取一管显色底物、2.5mL检测缓冲液，将显色底物溶于检测缓冲液中，摇匀，使其充分溶解在检测缓冲液中，放置于冰上，并在6小时内使用。③配置标准品工作液：对硝基苯酚（p-nitrophenol）标准品溶液（10mM）10μL，溶解于190μL的检测缓冲液中，使得总浓度为0.5mM。标准品溶液的用量分别为：4μL、8μL、16μL、24μL、32μL和40μL，所对应的最终样品浓度分别为：0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM和0.1mM。④样品准备：transwell板内，分别从腔侧和基底侧各取50μL，转移至96孔板中，然后再加入50μL的显色底物。⑤于37℃孵育30分钟，之后每孔加入100μL反应终止液，终止反应。用紫外分光光度法进行浓度测定，波长设置为405mm。见图2-5。图2-图2-5Caco-2细胞腔侧和基底侧的ALP的活力

BL:基底侧；AP：腔侧。

Fig.2-5ActivityofALPinthecavitiesandbasolateralsidesofCaco-2cells

BL:basolateral；AP：thecavityside荧光黄通透性检测方法：取1mg荧光素钠溶解于5mL的PBS中，配制0.2mg/mL荧光素钠储备液，用时5倍稀释成为10μL40μg/mL工作液。Caco-2细胞用PH7.4的Hanks平衡盐溶液（HBSS）反复、仔细冲洗3遍。并于37℃恒温孵育30分钟后，用移液枪将孔内的HBSS吸净，防止干扰。将浓度为40μg/mL的荧光黄工作液10μL，加入Transwell板顶端，于37℃恒温孵育一小时，之后收集Transwell板基底侧荧光黄工作液。并测定吸光度，λ激发=427nm，，λ发射=536nm。并由此获得荧光黄的标准曲线。其透过率计算公式为：透过率%=基底浓度/初始浓度*100%2.2Caco-2细胞屏障功能紊乱模型的构建不同浓度的胰酶业的配置：取1:250活力的胰蛋白酶粉48mg，溶于10mLPBS中，配制成浓度为200μM的胰蛋白酶母液；之后取母液100μL，溶于9.9mL的PBS中，配制成浓度为2μM的胰蛋白酶溶液；之后，再取浓度为10μM的胰蛋白酶溶液100μL，溶于9.9mL的PBS中，配制成浓度为20nM的胰蛋白酶溶液。然后以1mL每1.5mLEP管分装，放入-20℃冻存，并于用时放置于4℃，化冻备用。Hanks平衡盐溶液的配置：NaCl8g/L、KCl0.4g/L、葡萄糖1g/L、KH2PO460mg/L、Na2HPO447.5mg/L，配置后将PH值调至7.2。胰酶刺激浓度范围的摸索：取浓度分别为20nM、2μM、200μM的三种胰酶100μL溶液加入到培养18天Caco2细胞的12孔板transwell上层小室内，胰酶终浓度分别为10nM、1μM、100μM，孵箱孵育1小时后，测定跨膜电阻TEER值和荧光黄穿透率，根据电阻值和荧光黄穿透率的变化筛选胰酶处理浓度。2.3芍药苷对Caco-2细胞屏障功能的保护作用采用2.2建立的细胞屏障功能紊乱模型，研究芍药苷在低、中、高浓度的屏障保护作用，通过荧光黄的透过率进行测定。2.3.1药血清的制备：分5组SD大鼠，以随机分组的方式，空白对照组、芍药苷高剂量组（56mg/kg）、芍药苷中剂量组（28mg/kg）、芍药苷低剂量组（14mg/kg）、阳性药盐酸洛哌丁胺组（1.7mg/kg），每组3只，每天灌胃两次，间隔8小时，连续7天，于末次给药后半小时内，乙醚麻醉，腹主动脉取血，约10mL/只。取血后静置，血液分层，置于4℃、3000转/每分的条件下，离心10分钟，取上层血清之后，于56℃水浴锅中灭活30分钟，用0.22μm一次性无菌过滤器进行除菌、分装。置于-80℃冰箱保存备用。2.3.2蛋白酶抑制剂配置：精确称量蛋白酶抑制剂-硼替佐米0.0011g，溶于40μL的DMSO中，全部溶解后再加入3960μL的PBS，稀释100倍，配置浓度为275μg/mL的储备液，4℃保存备用。使用时吸取100μL储备液加入12孔板1mL血清中，终浓度为25μg/mL，DMSO终浓度<0.1%。2.3.4细胞分组及给药：Caco-2细胞形成单层上皮细胞屏障后，将细胞随机分为正常对照组（加入200μL空白血清）、屏障功能紊乱模型组（分别加入100μL空白血清和1μmol/L的胰蛋白酶100μL）、蛋白酶抑制剂对照组（加入100μL含蛋白酶抑制剂的血清和1μmol/L的胰蛋白酶100μL）及含芍药苷的血清处理组（加入100μL含芍药苷血清和1μmol/L的胰蛋白酶100μL）。2.3.5Caco细胞跨膜电阻值测定：在不同的时间对在2.3.4中进行给药处理的细胞的TEER值进行测定，于每一个Transwell小杯中取不同方位的三个点进行抽取，反复三次，取平均值。可以通过测定计算平均值×Transwell的膜面积计算出样品标准电阻值。为保证测定数值的准确性，整个测定过程均应在37℃恒温下进行。标准的TEER值=实际测量TEER值－空白对照TERR值2.3.6Caco-2细胞屏障荧光黄穿透率的测定：2.3.4处理的细胞给药后30分钟，细胞用HBSS液清洗3遍，HBSS液平衡30分钟，小室内侧更换荧光黄溶液400ul，孵育1小时后，收集小室内液和基底液。在激发波长427nm、发射波长536nm的条件下，使用荧光分光光度计对收集的液体进行吸光度的测定，计算其荧光黄的穿透力。2.4芍药苷对Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响WesternBlot方法检测紧密连接蛋白ZO-1表达水平：ZO-1蛋白是细胞保持细胞连接最重要的蛋白质之一ADDINNE.Ref.{61284409-3E9A-45D3-8AF4-7EB6C0E28F8C}[36]。采用Western印迹法检测紧密连接蛋白ZO-1的表达，不同组别的Caco-2细胞，经全蛋白提取试剂盒，提取总蛋白之后，通过BCA蛋白定量。每一个样本取出20μg的等量蛋白，在进行SDS电泳之后，各组加千分之一的多克隆兔抗ZO-1，4℃16小时，后以HRP进行标记，并进行显色（化学发光法）。再进行图像分析，以GAPDH为内参，分析定量ZO-1蛋白表达。2.4.1Caco2细胞培养和给药Caco2细胞培养于6孔板，18天细胞成为致密单层后，将细胞随机分为正常对照组（加入2000μL空白血清）、屏障功能紊乱模型组（分别加入1000μL空白血清和1μmol/L的胰蛋白酶1000μL）、蛋白酶抑制剂对照组（加入1000μL含蛋白酶抑制剂的血清和1μmol/L的胰蛋白酶1000μL）及含芍药苷的血清处理组（加入1000μL含芍药苷血清和1μmol/L的胰蛋白酶1000μL）。2.4.2Caco2细胞总蛋白提取实验前准备：实验前准备PBS放在4℃预冷（至少1小时）、冰盒/冰袋、裂解液（RIPA,PMSF，蛋白酶抑制剂，从-20℃取出，放在冰上化冻）、细胞刮、离心管：按样品标注2套，放置在冰上预冷、离心机提前制冷到4℃。实验步骤：（1）细胞处理：①配制裂解液：按96：1：4的比例加入裂解液（960uLRIPA+10μLPMSF+400μL蛋白酶抑制剂）放在冰盒里备用。②胰酶和相应药物处理Caco2细胞，1h后将细胞从孵箱取出，吸出所有培养基用预冷的PBS清洗3遍，清洗掉培养基里的血清（每次约1mL，上下左右轻微晃动清洗细胞，尽量避免细胞损失）。③将PBS吸净，确保无PBS残留。④加入事先配制好的细胞裂解液，按40μL/孔加入，使液体铺满板底，置于冰上作用至少5分钟。（2）收集细胞：裂解液作用5min后，①用细胞刮沿孔的边缘，从上往下刮，倾斜一定角度，等待液体以及细胞碎片全部汇集到孔底边，用200ul的枪头吸取所有液体，移入已标注好的1.5mL离心管中，放置在冰上。②6个孔逐个进行操作，每刮完一个孔便收集该孔的液体。③收集好的液体放置在冰上20min使裂解液与细胞充分作用。（4）超声破碎：①超声仪的探头浸入到液面以下，每个样品超声破碎3次，每次持续5s（如果收集细胞液较少可减少超声次数或时间，避免损失。）②更换组别时注意蒸馏水清洗超声仪枪头并擦拭干净。（5）离心取上清：全部样品离心，保持4℃，13000rpm，离心15min。小心吸出全部上清，收集在另一套标注好的1.5mL离心管中。2.4.3蛋白定量样品蛋白，通过BCA蛋白检测试剂盒，定量。按照说明书要求，用双蒸水将BSA的标准品稀释，稀释成μg/μL的浓度梯度。按照A液：B液=50:1的比例，每孔加200微升的A/B混匀液。以对应浓度的BAS标液代替标准曲线孔内溶液。将稀释5倍的蛋白提取液25μL，加入到样品孔中，加好之后，将试剂盒置于水平摇床上0.5min，震摇混匀。放置37℃恒温水浴箱孵育30min后取出，在读板机上于562nm测定样品光密度值，并且在5分钟之内进行结果的读数。并以浓度为横坐标，光密度为纵坐标，同时结合曲线回归拟合获取标准曲线。从而测丁的光密度值，带入标准曲线方程计算出样品蛋白浓度。然后计算出用水稀释将各组样品的蛋白总浓度归一所需要的蒸馏水量，稀释之后，各取100μL稀释后的蛋白样品，按照5×上样缓冲液：蛋白样品液＝1:4的比例，加入5×蛋白上样缓冲液，即25uL。加完后，涡旋1min混匀，然后在100℃下水浴10min，使蛋白变性。水浴完成后将样品放在-20℃或者-80℃冰箱中保存，上样前提前取出，在冰上融化。2.4.4Westernblot检测ZO-1蛋白表达溶液的配置分别配置分离胶和浓缩胶，电泳液、转膜液和封闭液，配置方法如下。30%丙烯酰胺：分别称取丙烯酰胺58g、甲叉丙烯酰胺2g，以120mL蒸馏水溶解，PH=7.0，稀释至200mL，经滤膜过滤（滤膜孔径为0.45μm），于4℃冰箱避光保存。10%SDS：称取10gSDS，称取100mL蒸馏水，将10gSDS溶解于100mL蒸馏水中，用孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，室温下储存备用。Tris-HCl缓冲液的配置：分别称取3.03gTris及5.76g氯化钾，以400mL蒸馏水溶解，以浓盐酸将调pH=7.4，后定容至500mL，于4℃保存。10%APS：准确称(NH4)2S2O8=0.1g，溶1mL水，临用临配，4℃避光保存。1.5MTris-HCl：准确称Tris=36.34g，溶于180mL蒸馏水，以浓盐酸调PH=8.8，定容至200mL，经孔径0.45μm的滤膜进行过滤后，4℃避光保存备用。0.5MTris-HCl（PH6.8）：精密称取Tris12.11g，溶解于180mL蒸馏水中，用浓HCl将PH调至6.8，稀释至200mL，经0.45μm滤膜过滤后，4℃避光保存备用。5×电泳缓冲液（5×runningbuffer，5L）：称取Tris75.5g，甘氨酸470g，溶解后，定容至5L，加入SDS25g，充分搅拌。使用时用4倍体积的水稀释为使用1×。5×转移缓冲液（5×Transferbuffer，5L）：准确称Tris=181.25g，Gly=90.625g，以5L水溶解并定容。一倍稀释液，以160mL+6