线粒体疾病的分子诊断

线粒体疾病的分子诊断第1页/共55页2线粒体（Mitochondrion）21.动物细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2.每个细胞含几百到几千个线粒体3.每个线粒体含2-10线粒体DNA（mtDNA）第2页/共55页3线粒体功能MitochondrialDisease.Chest2001;120:634–648ATP脂肪酸代谢三羧酸循环氧化磷酸化第3页/共55页其他功能

储存钙离子调节膜电位并控制细胞程序性死亡细胞增殖与细胞代谢的调控合成胆固醇及某些血红素

——Wikipedia第4页/共55页线粒体病

Mitochondrialdisorders发现-1962年，Lufe等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率，同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年，Wallace等报道了首例由线粒体DNA突变引起的人类疾病，明确了mtDNA突变可引起人类疾病。

定义-是遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，致使ATP合成障碍、能量来源不足导致的一组异质性病变，又称为线粒体细胞病。发病率-约为1:5000（约每5000人中1人发病）Smeitink2006第5页/共55页线粒体病mitochondrialdisorders——是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病线粒体蛋白16,569bpcirculardoublestranded(mtDNA)20%1,500nucleargenes

80%（结构和功能）

structuralproteinoftheOXPHOScomplexes

proteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexes

proteinsinvolvedinmtDNA

translation

proteinsinvolvedinmtDNA

maintenance

proteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfissionDouglasC.Wallace,1817–1819——Shoubridge,2001;Schapira，2000第6页/共55页进一步导致线粒体功能异常：①底物的运输缺陷；②底物的利用缺陷；③柠檬酸循环异常；④氧化磷酸化脱偶联；⑤呼吸链异常。第7页/共55页发病特点

核基因突变——常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传

（目前已鉴定的核基因突变约40种）

线粒体基因突变——母系遗传

（突变的mtDNA在母血增加，受累及的后代发病频率增加）mtDNA突变与临床表型之间关系复杂，主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型，而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。遗传异质性婴幼儿起病较常见第8页/共55页

编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹（PEO）、线粒体神经肠胃脑肌病、Leigh氏综合征

线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16(MRPS16)纯合突变，导致先天畸形伴张力衰竭、四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症，该女婴在出生后3天死亡。核基因突变第9页/共55页线粒体基因突变突变的影响：引起呼吸链功能缺陷氧化磷酸化酶异常阈值效应：组织特异性复制分离母系遗传：不同突变后代发病风险不同。

相比A8344G突变，携带A3243G突变的母系后代更容易发病。突变分布：同质性——各器官组织分布相同异质性——不同组织、细胞分布不同

一般特点第10页/共55页同质性突变与异质性突变11线粒体基因同质性（Homoplasmy）0或100%异质性（Heteroplasmy）0-100%核基因纯合子（Homozygous）0或100%杂合子（Heterozygous）50%第11页/共55页线粒体基因突变点突变目前已报道的mtDNA点突变将近330种，涉及mtDNA编码的各个基因，其中结构基因突变177种、tRNA基因突变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排重排突变逾数百遗传性痉挛性截瘫等

(http：//)第12页/共55页线粒体疾病是复杂性疾病遗传方式复杂常染色体隐性遗传（AutosomalRecessive）常染色体显性遗传（AutosomalDominant）性连锁遗传（Sexlinked）母系遗传（Maternallyinherited）临床表型复杂累及多系统（Multisystemicinvolvement）影响几乎所有组织器官（Anyorganortissuecanbeaffected）

13第13页/共55页线粒体病的共同临床特点

婴儿期发病：

常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。

儿童发病：

见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。

中枢神经系统损害：

共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等

周围神经损害：

交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征

视听神经损害：

视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型听力丧失出现在KSS

肌肉病

见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO（高度临床变异性）Chinneryetal.Lancet2000第14页/共55页线粒体疾病的生化诊断当一个患者的基因变异不能被确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢产物分析（血液、尿液、脑脊液等）血液可以正常，但脑脊液多异常，（动脉比静脉好）；乳酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线粒体疾病酶测定

氧化磷酸化（OXPHOS）系统的酶活性测定。（western、比色法等）方法不稳定一般情况下，血清CK正常或轻度升高；升高占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹；mtDNA丢失时非常高。肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点：（1）出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或RRF为主要病理改变。（2）上述病理改变出现的频率高。（3）缺乏其他的肌肉病理改变。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第15页/共55页儿童及成人线粒体疾病的诊断标准A符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等；多系统不明原因发病必须至少三个系统出现临床症状除先证者外，至少有一个母系家族成员有发病可能排除其它代谢和非代谢疾病B肌活检在骨骼肌中存在>2%破碎样红肌纤维C有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现：

50岁以下肌活检COX阴性肌纤维>2%；50岁以上肌活检COX阴性肌纤维5%；任一组织种呼吸链酶活性<20%；任一细胞系中呼吸链酶活性<30%；多于两组织内相同呼吸链酶活性<30%；主要诊断标准(Bernieretal,2002)(3,5)第16页/共55页次要诊断标准：A症状符合线粒体脑肌病的临床表现；至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现：①30~50岁肌活检RRF在1%~2%；②30岁以下肌活检出现RRF；③电镜下见广泛线粒体异常；B

至少一种呼吸链功能受抑制的表现：①生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%~30%；②用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少；C发现可能相关的mtDNA异常；D一种或多种氧化磷酸化受损的表现：①脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高；②若疑为KSS，脑脊液蛋白质增高；③PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低；④最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。(Bernieretal,2002)(3,5)第17页/共55页

符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病；符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病；

符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。JinheritMetabDis.2011April;34(2):283-292第18页/共55页线粒体病诊断时应注意

基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活性等相结合

要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变

线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系

散发与遗传的相关性，诊断是否遗传需排除环境、药物和衰老等因素第19页/共55页第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病20第20页/共55页21人类线粒体基因组Lightstrand:8tRNAand1mRNA(ND6)Heavystrand:14tRNA,2rRNA,and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing

基因组小,仅16569bp

双链环状DNA

13结构基因

/mRNA22tRNA基因

2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNA基因

非编码区D-loop（约1120bp）

L链复制起始区（约30～50bp，tRNAAsn-tRNACys）

高突变率线粒体基因组及其表达系统第21页/共55页ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand,andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand.Theheavystrandencodes28genes,andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes.Ofthe37genes,13areforproteins(polypeptides),22arefortransferRNA(tRNA)andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA(rRNA).第22页/共55页2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT-RNR1(12SrRNA)MT-RNR2(16SrRNA).第23页/共55页HumanmitochondrialDNA(mtDNA)hasthreepromoters,H1,H2,andL(heavystrand1,heavystrand2,andlightstrandpromoters).TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand.TheH2promotercausesthetranscriptionofthetwomitochondrialrRNAmolecules.第24页/共55页Theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvesthreetypesofproteins:themitochondrialRNApolymerase(POLRMT),2.mitochondrialtranscriptionfactorA(TFAM),3.mitochondrialtranscriptionfactorsB1andB2(TFB1M,TFB2M).第25页/共55页第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病26第26页/共55页核基因组与线粒体基因组的相互作用27核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制第27页/共55页第一节

线粒体基因组与疾病线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异碱基突变：点突变。其中结构基因的点突变，与核基因组一样，包括同义突变和错义突变缺失与插入：mtDNA拷贝数目突变：线粒体基因组变异与疾病耳聋，Leber遗传性视神经病变，糖尿病，高血压，肿瘤28第28页/共55页29在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G(80%),T3271C（在tRNALeu(UUR)基因）MERRF（肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维）：A8344G(80%),T8356C（在tRNALys基因）Leber视神经病（LHON）：G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）耳聋（Deafness）:A1555G,T1494C（在12SrRNA基因）A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）2型糖尿病（Type2Diabetes）:A3243G（在tRNALeu(UUR)基因）

NARP（共济失调伴色素性视网膜炎神经病）：T8993G,T8993C（在ATPase6基因）第29页/共55页线粒体病的分子诊断标本选择：

外周血白细胞——最常用毛发唾液尿液

骨骼肌——检测mtDNA分子诊断的最好标本第30页/共55页检测已知DNA突变的方法：等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）等位基因特异性扩增（ASA）限制性片段长度多态性分析（PCR-RLFP）连接酶链反应（LCR）基因芯片技术检测未知DNA突变的方法：单链构象多态性（PCR-SSCP）变性梯度凝胶电泳（DEEG）异源双链分析（HA）DNA序列测序变性高效液相色谱（DHPLC）分子诊断方法第31页/共55页线粒体疾病中常见的突变核基因突变（nucleargenemutations）氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质,例如:Surf1,SCO2,NDUFV1,NDUFS1,etc.呼吸链缺陷:重复、缺失线粒体DNA点突变（mtDNApointmutations）LHON,MELAS,MERRF,NARP,etc.mtDNA缺失/重复（mtDNADeletions/duplications）

eg.KSS,Pearsonsynd,diabetes&deafness未知遗传（unknowninheritance）32第32页/共55页第二节

线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测33第33页/共55页第二节

线粒体基因组与耳聋与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术34检测位点引物序列(5′～3′)退火温度(℃)产物长度(bp)A1555GC1494TCGATCAACCTCACCACCTCT58802TGGACAACCAGCTATCACCAA7445GACGCCAAAATCCATTTCACT58987CGGGAATTGCATCTGTTTTT第34页/共55页第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变常用检测技术35第35页/共55页DegenerationofretinalganglioncellsandtheiraxonsInheritedfrommaternalmitochondrialDNAOccursduringyoungadulthood第36页/共55页AcutePhase:Painless,acuteonsetofcentralvisionlossLossofvisualacuity/colouroncesymptomsappearinoneeye,othereyeaffectedweekslaterSubacutePhaseatrophyofopticdisclegallyblindAsymptomaticuntilvisualblurringdevelopsSignsandSymptoms第37页/共55页MaternalinheritanceMutationoccursinmitochondrialDNA(mtDNA)OnlytheeggcontributesmtDNAtotheembryoGeneticsofLHON第38页/共55页(1)G11778A:50-60%LHONpopulation(2)G3460A:8-25%LHONpopulation(3)T14484C:10%LHONpopulationSinglePointMutations

3majorpathogenicmutations:第39页/共55页G14459AT14484C第40页/共55页presenceofmixtureofmorethanonetypeoforganellargenomeiemtDNANumerouscelldivisionsandthuslotsoftimeisrequiredformutantallelestobeexpressedinmitochondriaSymptomsdon’tappearuntiladulthoodAlsoimplicatedasthereasonforvariabilityinseverityofvisionlossHeteroplasmy第41页/共55页VisiondamagefromdegenerationofopticnerveMaternallyinheritedthroughmtDNA3pointmutationsComplexIROS(reactiveoxygenspecies)TreatmentAntioxidantsInhibitmitochondrial-dependentapoptosis第42页/共55页第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技术PCR-RFLP技术PCR-SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术43G3460A，G11778A，T11484C原发性突变测序图第43页/共55页第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于β细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的1～3％据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为2.96%线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断44第44页/共55页第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断45第45页/共55页第四节

线粒体与糖尿病线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断PCR技术正向引物（F）：5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′反向引物（R）：5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′扩增片段398bp（3153～3551bp）DHPLC技术PCR-RFLP技术DNA测序技术46第46页/共55页分子诊断研究（A3243G异质性分析）收集病人外周血抽提DNAPCR扩增目的片段

PCR-RLFP测序验证RT-ARMs-qPCRPyrosequencing

TargetedNext-GenerationSequencingHigh-throughputsequencing实例第47页/共55页母系遗传糖尿病家系注：母系成员共24人，其中糖尿病患者为10人。相应PCR产物经普通测序验证：MIDD:第48页/共55页PCR-RFLP图含mtDNA3243PCR产物的限制性内切酶（ApaI）酶切结果图mtDNA3243异质性突变检测结果M：DNAmarker；Lane1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17：mtDNA3243异质性突变；Lane4、5、14、15：mtDNA3243未突变；限制酶ApaⅠ的酶切位点(GGGCC↓C),由于该突变为异质性突变,故应该会出现553、423、