叶绿素和可溶性糖试验方法步骤

试验方法与步骤：、叶绿素含量的测定：将叶片（所有处理都取同一部位）剪碎混匀，每处理称取约0.2g叶片（3次重复）放于研钵，加入少量石英砂及碳酸钙及3ml左右80%的丙酮，研成匀浆，再加10ml80%的丙酮，继续研磨至组织变白静置3分钟左右，过滤入25ml试管（事先用报纸包裹遮光），用80%的丙酮多次冲洗研钵、研棒、残渣及滤纸，直至无绿色。80%的丙酮定容。80%的丙酮然为空白，取样液于比色杯中在波长663nm、646nm、470nm下测定吸光度。以Lichtenthaler法计算叶绿素含量及类胡萝卜素含量。Ca=12.21A663-2.81A646Cb=20.13A646-5.03A663C=（1000A470-3.27Ca-104Cb）/229= mg/L求得色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：叶绿体色素的含量=（色素的浓度X提取液体积X稀释倍数）/样品鲜重或干重=mg/g二、酶的粗提取液A：0.2MNaH2PO4 31.21gNaH2PO4.2H20定容至1000mlB：0.2MNa2HPO4 71.64gNa2HPO4.12H20定容至1000ml0.05mol/L的磷酸缓冲液（PH=7.8）：21.25mlA力口228.75mlB,用水定容至1000ml选取长势相同的植株，每组处理取叶片0.5g，3次重复，放入预冷的研钵中，先加入1ml0.05mol/L的磷酸缓冲液（PH=7.8）及少量石英砂（为了离心时平衡最好提前称取0.2g石英砂20份），冰浴中研磨成匀浆，转移至离心管中，再用4ml上述缓冲液多次冲洗研钵及钵棒，合并入离心管，总体积为5ml，摇匀后冷藏静置4小时以上，3000r/min离心15min（0〜4°C），上清液即为酶的粗提取液,4C保存。（1）•可溶性蛋白含量测定，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定考马斯亮蓝G-250溶液的配制：.1g考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中，加入85%的磷酸100ml并用蒸馏水定容至1000ml；过滤于棕色瓶中保存（最多保存一个月）。标准曲线的制作1mg/mL蛋白标准样：准确配制1mg/mL白蛋白溶液为标准样，按下表在各管中加样，配制成一系列不同浓度的白蛋白溶液。管号管号管号管号管号管号012345标准白蛋白（mL）00.020.040.060.080.1磷酸缓冲液或蒸馏水（mL）0.1(100uL)0.080.060.040.020考马斯亮兰G250（mL）333333蛋白含量（mg）00.020.040.060.080.1将溶液摇匀后，静置2min。在595nm波长下测其吸光度值，用空白管溶液调零点，以0D值为横坐标，白蛋白量（mg）为纵坐标绘制标准曲线。可溶性蛋白的测定：lOOul酶液+3mlG250，充分混合均匀后准确放置2min，在595nm波长下比色并记录。同时做空白（lOOul磷酸缓冲液+3mlG250）。比色皿和试管用酒精冲洗（每次都要用少量酒精清洗，再用蒸馏水洗）。结果计算：样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=（CXV/a）/wC：查标准曲线（参照蛋白标准曲线）所得每管蛋白质含量（mg）；V：提取液总体积（mL）a：测定所取提取液体积（mL）w：取样量（g）（2）•过氧化物酶（POD），采用愈创木酚法测定。POD反应液的配制：0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液100mL于烧杯中，加入愈创木酚56uL，用磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，待溶液冷却至室温后加入30%H2O28uL混合均匀，冷藏保存于冰箱中（0〜4°C,且要密封保存）。POD的测定：20uL酶上清液+3mLPOD反应液加入比色皿中，以不加酶液而加相同体积的磷酸缓冲液为空白对照。在470nm波长下每隔1min比色读数一次共3次；以每min每mg蛋白吸光度变化0.01（△A470/min.g.FW）表示酶活性的大小。结果计算：POD酶活性=100X（AA470XV）/（aXWXt）V：样液总体积（mL） a：测定时样品体积（mL）W：样品重（g） t：反应时间（min）（3） •过氧化氢酶（CAT）活性测定，采用紫外吸收光测定。（CAT反应液）0.1mol/L的H2O2:5.68mL市售30%H2O2稀释至1000mL反应液的配制：0.1mol/L的H2O215mL+0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液60mL,混合均匀。CAT的测定：0.1mL酶液（先加，直接加到比色皿）+2.5mLCAT反应液，于240nm波长下比色，以0.1mL磷酸缓冲液+2.5mLCAT反应液作空白对照。每隔1min读数1次（共3次）；以每min每mg蛋白吸光度变化值0.01表示酶活性。结果计算：CAT酶活性（△A240min.g.FW）=（△A240XV）X100/（aXWXt）V：样液总体积（mL） a：测定时样品体积（mL）W：样品重（g） t：反应时间（min）（4） ・SOD0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.8）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL750umol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，遮光保存100umol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000mL20umol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL，遮光保存反应液：磷酸缓冲液与后四种溶液以5：3:3:3:3的比例混合测定：取0.1mL上述酶提取液（4支对照加0.1mL磷酸缓冲液），弱光下迅速加入2.9mL反应液，2支对照置于暗处用于调零，其余各管均置4000lx下反应30min,盖黑布终止反应,，用紫外分光光度计在560nm下测定其吸光度。(注意要求各管透明度好并且统一规格)SOD酶活性=(A0-A)XVT/(AX0.5XWXV)0s T0 1式中：A0：对照管吸光度；As：样品管吸光度；VT：样液总体积(mL)V:测定时样品体积(mL)； W：样品重(g)1(5)・MDA(丙二醛)含量测定0.67%硫代巴比妥酸(TBA)取上述酶提取液2mL,加0.67%的TBA溶液4mL,封口沸水浴15min,迅速冷却后再离心,取上清液。在660nm、532nm、450nm下测定其吸光度,通过以下公式求得浓度。C(umol.L-1)=6.45X(A-A)-0.56XA532 600 450MDA(umol.g-1)=CXV/W式中：V：样液总体积(mL)；C：MDA浓度(umol.L-1)；W：样品重(g)三、可溶性糖含量蔥酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蔥酮1g,溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中,在黑暗中可保存数周,如有结晶析出,可微热溶解。1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80°C下烘至恒重，精确称取l.OOOg。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。管号管号管号管号管号管号012345标准糖(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.0糖量(ug)020406080100100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。称取0.3g样品鲜叶，加10mL蒸馏水，封口沸水浴1h(30min1次，共提取2次），用滤纸漏斗过滤，反复冲洗残渣定容至25mL刻度试管中。吸取提取液ImL,加蒸馏水ImL（对照加2mL）,蔥酮乙酸乙酯0.5mL,再加入浓硫酸5mL,充分振荡，沸水浴准确计时lmin,自然冷却至室温，于630nm下比色。同时用分析纯蔗糖作标准曲线,按照以下公式计算可溶性糖的含量。可溶性糖含量=（CXV/aXn）/（WX106）式中：C：标准方程求得糖量（ug）a：吸取样液体积（mL）V：提取液量（mL）n：稀释倍数W：材料重量（g）四、脯氨酸2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6Mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制,此液在4°C下2〜3d有效；冰醋酸、甲苯、磷酸3%的磺基水杨酸：3g磺基水杨酸溶于100mL水中。绘制标准曲线脯氨酸标准溶液准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250mL,其浓度为lOOug/mL。再取此液lOmL，用蒸馏水稀释至lOOmL，即成lOug/mL的脯氨酸标准液。管号管号管号管号管号管号O12345lOug/mL的Pro标准液(mL)OO.2O.4O.6O.81.O蒸馏水（mL）2.O1.81.61.41.21.OPro(ug)O24681O称取O.3g叶片鲜样，加入3%的磺基水杨酸5mL,加盖沸水中提取lOmin,冷却至室温后过滤，吸取滤液2mL（及标准样