生物化学课件第二章 核酸化学

第二章核酸化学Chapter2BiochemistryofNucleicAcid本章内容

1.1核酸的化学组成及一级结构1.2DNA的空间结构与功能1.3RNA的结构与功能第一节核酸的结构与功能第二节核酸的理化性质、变性和复性及其应用第一节核酸的结构与功能Section1StructureandFunctionofNucleicAcid染色体非组蛋白What’snucleicacid?核酸的发现：1869年瑞士米歇尔核酸的定义：生物体内一类含有磷酸基团的重要生物大分子（酸性物质），是遗传变异的物质基础，是遗传信息的载体，在蛋白质的生物合成中起重要的作用。细胞质细胞细胞核核酸DNA若干基因组蛋白核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)RNA主要参与遗传信息的表达;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)DNA是遗传信息的载体;核酸的分类：RNA和DNA都是以单核苷酸(nucleotide)为基本单位所组成的多核苷酸长链。1869年F.Miescher首先从伤员绷带的脓细胞中分离得到称为“核素”的核酸1944年O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA双螺旋结构模型1958年Crick提出遗传信息传递的中心法则1970年,建立DNA重组技术1980年后,分子生物学、分子遗传学等学科突飞猛进发展，提出并完成HGP.核酸化学的发展过程

“四核苷酸假说”：核酸由四种核苷酸组成的单体构成的，缺乏结构方面的多样性,不大可能有重要的生理功能。1928年，英国

S型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑R型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙著名的肺炎球菌实验

结果说明？结果说明：加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质，可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌这种生物分子或遗传物质是什么呢？著名的肺炎球菌实验

纽约洛克非勒研究所Avery从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来，分别加入到无害的R型肺炎球菌中，结果发现，惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌。1944年结论：DNA是生命的遗传物质1.1TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid

1.1核酸的化学组成及一级结构核酸的水解产物：核酸核苷酸磷酸核苷戊糖含氮碱核糖脱氧核糖嘌呤碱嘧啶碱1.嘧啶碱(pyrimidine)：

一、核苷酸中的碱基组成

尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶Uracil，UCytosine，CThymine，T312456NNONNOHHNNOHNH2NNOOHHCH32.嘌呤碱(purine)：

312456789腺嘌呤(adenine,A)鸟嘌呤(guanine,G)NNNNHNH2NNNNHNNNNHNH2OH二、戊糖与核苷

1．戊糖(pentose)：

1´（构成RNA）-D-核糖(ribose)（构成DNA）-D-脱氧核糖(deoxyribose)2´3´4´5´OHOCHOHOHOH22．核苷(nucleoside)：

核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1′-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合，故生成的化学键称为，N糖苷键。腺苷(AR)脱氧胞苷(dCR)β1,N9-糖苷键β1,N1-糖苷键β1β1N9N1OH碱基和核糖的缩合物，以N-糖苷键相连；成苷位置：

核糖C-1与嘧啶N-1；核糖C-1与嘌呤N-9。核苷：

腺苷A，鸟苷G，胞苷C，尿苷U；脱氧核苷：

脱氧腺苷dA,脱氧鸟苷dG,脱氧胞苷dC,脱氧胸苷dT；2．核苷(nucleoside)：

三、核苷酸的结构与命名核苷酸(nucleotide)是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括:核糖核苷酸:5-AMP,5-GMP,5-CMP,5-UMP脱氧核糖核苷酸:5-dAMP,5-dGMP,5-dCMP,5-dTMP与磷酸基缩合的位置：2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。最常见的核苷酸是5-核苷酸（5常被省略）5-核苷酸的分子结构

5-核苷酸又可按其在5位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。

核苷酸的命名及缩写符号脱氧碱基磷酸基数目磷酸dAMPGDTTCU核酸的一级结构一分子核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。3',5'-磷酸二酯键的形成多核苷酸链核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。核酸是的方向性：多核苷酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3-端。5′端3′端CGA多核苷酸链简写方法书写方向规定为：

5-端→3-端。5′端3′端CGA5’-CAG…….-3’DNA分子：由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP组成。

DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式(3,5-磷酸二酯键)。RNA分子：由AMP，GMP，CMP，UMP组成。

RNA的一级结构就是指RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。

核酸的一级结构DNA的一级结构：

5-AGTCCATG-3AGTCCATG3-TCAGGTAC-5RNA的一级结构：

5-AGUCCAUG-3AGUCCAUG

核酸一级结构的表示方法1.2DNA的空间结构与功能1.2DimensionalStructureandFunctionofDNA一、DNA的二级结构——双螺旋结构模型DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型（获1962年度诺贝尔奖）。JamesWatson(L)andFrancisCrick(R),andthemodeltheybuiltofthestructureofDNA（一）对DNA双螺旋结构模型作出贡献的科学家1.OswaldAvery(1877-1955)MicrobiologistAveryledtheteamthatshowedthatDNAistheunitofinheritance.OneNobellaureatehascalledthediscovery"thehistoricalplatformofmodernDNAresearch",andhisworkinspiredWatsonandCricktoseekDNA'sstructure.——Nature,20032.ErwinChargaff(1905-2002)ChargaffdiscoveredthepairingrulesofDNAletters,noticingthatAmatchestoTandCtoG.Helatercriticizedmolecularbiology,thedisciplinehehelpedinvent,as"thepracticeofbiochemistrywithoutalicence",andoncedescribedFrancisCrickaslookinglike"afadedracingtout".——Nature,20033.LinusPauling(1901-1994)Thetitanoftwentieth-centurychemistry.Paulingledthewayinworkingoutthestructureofbigbiologicalmolecules,andWatsonandCricksawhimastheirmaincompetitor.Inearly1953,workingwithoutthebenefitofX-raypictures,hepublishedapapersuggestingthatDNAwasatriplehelix.——Nature,20034.RosalindFranklin(1920-1958)Franklin,trainedasachemist,wasexpertindeducingthestructureofmoleculesbyfiringX-raysthroughthem.HerimagesofDNA-disclosedwithoutherknowledge-putWatsonandCrickonthetracktowardstherightstructure.Shewentontodopioneeringworkonthestructuresofviruses.——Nature,20035.MauriceWilkins(1916-)LikeCrick,NewZealand-bornWilkinstrainedasaphysicist,andwasinvolvedwiththeManhattanprojecttobuildthenuclearbomb.WilkinsworkedonX-raycrystallographyofDNAwithFranklinatKing'sCollegeLondon,althoughtheirrelationshipwasstrained.HehelpedtoverifyWatsonandCrick'smodel,andsharedthe1962Nobelwiththem.——Nature,20031953年由Franklin和Wilkins等人完成的研究工作，发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射，并证明DNA是一种螺旋构象。

Fig.516.JamesWatson(1928-)WatsonwenttouniversityinChicagoaged15,andteamedupwithCrickinCambridgeinlate1951.Aftersolvingthedoublehelix,hewentontoworkonvirusesandRNA,anothergeneticinformationcarrier.Healsohelpedlaunchthehumangenomeproject,andispresidentofColdSpringHarborLaboratoryinNewYork.——Nature,20037.FrancisCrick(1916-2004)Cricktrainedandworkedasaphysicist,butswitchedtobiologyaftertheSecondWorldWar.Afterco-discoveringthestructureofDNA,hewentontocrackthegeneticcodethattranslatesDNAintoprotein.HenowstudiesconsciousnessatCalifornia'sSalkInstitute.——Nature,2003典型的双链DNA二级结构DNA右手双螺旋结构模式的设计者：

Watson与Crick，1953年。设计主要依据：（1）对DNA分子X射线衍射图分（2）碱基摩尔含量的比率关系（3）四种碱基的理化数据分析DNA的双螺旋结构的形成5´3´5´3´5´3´5´3´磷酸核糖碱基T-A碱基对C-G碱基对DNA的双螺旋模型特点

两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴右旋相互盘绕而形成。

磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组成位于外侧，作为可变成分的碱基位于内侧，链间碱基按A—T，G—C配对（碱基配对原则，Chargaff定律）

螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（basepair,bp）重复一次，间隔为3.4nm

氢键碱基堆集力磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和碱基处于疏水环境中DNA的双螺旋结构稳定因素

DNA的双螺旋结构的意义

该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。DNA双螺旋的不同构象目前已知DNA双螺旋结构可分为：A、B、C、D（右手双螺旋）Z型（左手双螺旋）

三种DNA双螺旋构象比较A-DNAZ-DNAB-DNAABZ外型粗短适中细长螺旋方向右手右手左手螺旋直径2.55nm2.37nm1.84nm碱基直升0.23nm0.34nm0.38nm碱基夹角32.7034.6060.00每圈碱基数1110.412轴心与碱基对关系2.46nm3.32nm4.56nm碱基倾角1901090糖苷键构象反式反式C、T反式，G顺式大沟很窄很深很宽较深平坦小沟很宽、浅窄、深较窄很深B型DNA双螺旋结构模式图（二）DNA双螺旋结构模型(B型)的要点：(1)两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴形成右旋的双螺旋结构。(2)碱基位于双螺旋的内侧，磷酸和核糖在外侧；(3)碱基配对原则：A=T(2)，G=C(3)；(4)螺旋参数：每螺旋10对,螺距3.4nm；(5)小沟，大沟；碱基配对及氢键形成B型双螺旋DNA的结构特征

二、DNA的三级超螺旋结构及在染色质中组装超螺旋结构(superhelix

或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。

绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。（一）原核生物DNA的高级结构：（二）DNA在真核生物细胞核内的组装：在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体(nucleosome)。核小体结构属于DNA的高级结构。核小体的结构核小体、染色质与染色体三、DNA的功能DNA的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因（gene）。一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp，大肠杆菌为5.7×106bp，人为3.2×109bp。Newtopic:DNAsequencingHowweobtainthesequenceofnucleotidesofaspecies…ACGTGACTGAGGACCGTGCGACTGAGACTGACTGGGTCTAGCTAGACTACGTTTTATATATATATACGTCGTCGTACTGATGACTAGATTACAGACTGATTTAGATACCTGACTGATTTTAAAAAAATATT…SangerMethod1.AsinglestrandofDNAtobesequenced(yellow)ishybridizedtoa5’endlabeledsyntheticdeoxynucleotideprimer(Brown).2.TheprimeriselongatedusingDNApolymeraseinfourseparatereactionmixturescontainingfournormal

deoxynucleotide

triphosphates(dNTPs)plusoneof

dideoxynucleotide

triphosphate(ddNTPs)inaratioof100:1.3.Ineachtube,theprimerenlongationisterminatedbytheincorporationofadideoxynucleotide

triphosphateintothenewlysynthesizedchain.Forshortchainlength,Forlongchainlength,4.ThesynthesizedDNAchainscanthenbeseparatedbygelelectrophoresis.Usingthisgelanalysisoffragments,thesequenceofthetemplateDNAchainbedetermined.Maxam-Gilbert法测DNA序列1.3RNA的结构与功能1.3StructureandFunctionofRNA组成：4种核苷酸(A,U,G,C)，有稀有碱基；连接：同DNA形成：一般以DNA为模板合成，有例外。结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。（一）RNA的结构

（二）RNA的类型三种：信使RNA（messengerRNA,mRNA)

核糖体RNA(ribosomelRNA,rRNA)

转运RNA(transferRNA,tRNA)RNA此外，在真核细胞中还有少量：核内小RNA（snRNA）:

参与核糖体的组成。不均一RNA（hnRNA）：

mRNA的前体。反义RNA（asRNA）：可与mRNA部分或全部序列互补；抑制DNA复制、转录；抑制mRNA翻译。mRNA、rRNA

、tRNA的功能mRNA分子中带有遗传密码，其功能是为蛋白质的合成提供模板(templet)。

mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码（coden)。rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。rRNA与蛋白质一起构成核糖体，作为蛋白质生物合成的场所。tRNA在蛋白质的生物合成过程中转运氨基酸。1、tRNAtRNA是分子最小，但含有稀有碱基最多的RNA，其稀有碱基的含量可多达20%。tRNA是保守性最强的RNA。tRNA是单链核酸，但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。约占全部RNA的15%；由70-90个核苷酸组成许多种类；沉降系数4S。RNA携带氨基酸辨认并结合氨基酰tRNA合成酶识别mRNA上的密码识别并结合核蛋白体氨基酸臂DHU臂反密码臂可变臂TC臂（二）tRNA的三级结构（倒L型）：氨基酸接受臂与反密码子环分别位于两端；分子上有两个双螺旋区；构象靠非螺旋区的碱基之间的氢键维持。A、在pr合成中转运aa；B、在pr合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。2）tRNA功能：2、mRNA1）合成：以DNA为模板(核内)

合成

hnRNA（含内含子和外显子）加工成熟的mRNA

入细胞质蛋白质合成RNA合成mRNA切除内含子2)mRNA结构特点：3‘末端有polyA结构：与mRNA从核入质有关。

5‘末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。3)功能：是蛋白质合成的模板3、rRNA1)占RNA总量的80%，是构成核糖体的骨架。2)核糖体功能：

pr合成的部位.3）结构：分大、小亚基一、二级结构多已确定，但功能不清。RNA原核细胞：70S核糖体；(23S,5S,16SrRNA)真核细胞：80S核糖体；(18S,28S,5.8S,5SrRNA)4、RNA的功能1）在DNA复制、转录、翻译中起重要调控作用；2）有催化作用；3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。RNA第二节核酸的理化性质、变性和复性

及其应用Section2ThePhysicalandChemicalCharacters,DenaturationandRenaturationofNucleicAcid,aswellastheirApplications一、核酸的一般理化性质

两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微溶于水，不溶于有机溶剂

线性大分子（粘度高,抗剪切力差）可用电泳或离子交换（色谱）进行分离室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色

D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色二、核酸的紫外吸收特性1、紫外吸收性质

max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：

纯DNA:A260/A280>1.8

纯RNA:A260/A280>2.0

二、核酸的紫外吸收特性1、紫外吸收性质

max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：

纯DNA:A260/A280>1.8

纯RNA:A260/A280>2.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光二、核酸的紫外吸收特性1、紫外吸收性质

max=260nm2、应用以A260/A280进行定性、定量及纯度测定：

纯DNA:A260/A280>1.8

纯RNA:A260/A280>2.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光减色效应2202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收1231天然DNA2变性DN1A3核苷酸总吸收值三、DNA的变性天然核酸在理化因素作用下，其双螺旋的氢键断裂，碱基堆积力不再存在，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为无规则线团状的单链DNA单链现象称为DNA的变性(denaturation)。引起DNA变性的因素：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。DNA的变性过程加热部分双螺旋解开无规则线团链内碱基配对①增色效应(hyperchromiceffect)：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；②旋光性下降；③粘度降低；④生物学功能丧失或改变。DNA变性后的性质改变：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，meltingtemperature,Tm）。DNA的变性温度Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。四、DNA的复性与分子杂交将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火annealing），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。将变性DNA经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度＝Tm－25℃复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度DNA的复性两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交(hybridization)。核酸的分子杂交(hybridi