基因工程原理dna分子的切割与连接

基因工程原理dna分子的切割与连接基因工程原理dna分子的切割与连接第1页切割DNA分子1970年以前没有特定位点切割DNA方法核酸内切酶化学方法机械切割2基因工程原理dna分子的切割与连接第2页噬菌体宿主限制和修饰现象生化机制纯化大肠杆菌K12限制性内切酶流感嗜血杆菌中存在一个酶，能够识别双链DNA分子中一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定分离片段。3基因工程原理dna分子的切割与连接第3页限制和修饰系统是一把双刃剑为DNA操作提供了丰富而有用酶类这些系统能够极大地影响重组DNA在克隆宿主中存活4基因工程原理dna分子的切割与连接第4页宿主控制限制与修饰限制系统使细菌能够监控DNA起源，并在它识别外源DNA时加以破坏。限制性内切酶识别是引入DNA中特定序列，并特异地或更随机地把DNA切割成片段。切割噬菌体基因组，降低侵染效率。5基因工程原理dna分子的切割与连接第5页6基因工程原理dna分子的切割与连接第6页限制和修饰(R--M)类型7基因工程原理dna分子的切割与连接第7页I型系统K12有活性酶由两个限制亚基、两个修饰（甲基化）亚基和一个识别亚基组成。识别序列较长，且不含有对称性等可识别特征。靶DNA可能在切割前受到修饰，所以对基因操作没什么意义。III型酶含有对称识别序列，不过其它方面类似于I型系统，一样没什么价值。8基因工程原理dna分子的切割与连接第8页II型系统大个别有用R-M系统属于II型，它含有众多优点：限制和修饰是由不一样酶介导限制活性不需要ATP或S-腺苷甲硫氨酸识别特定序列，切割产生粘性末端IIs系统在识别位点一段距离之外产生限制，其用途也受到限制。9基因工程原理dna分子的切割与连接第9页命名法10基因工程原理dna分子的切割与连接第10页11基因工程原理dna分子的切割与连接第11页识别序列大个别II型限制性内切酶识别4-8个碱基特定序列，并在该序列内切断DNA，该序列含有旋转对称双重轴。12基因工程原理dna分子的切割与连接第12页EcoRI13基因工程原理dna分子的切割与连接第13页14基因工程原理dna分子的切割与连接第14页其它限制性内切酶15基因工程原理dna分子的切割与连接第15页同裂酶：含有相同序列特异性和切割位点限制酶新裂酶：识别相同序列，但切割位点不一样酶（如SmaI和XmaI）星活性：在极端条件下，限制性内切酶能够切割类似但不一样于其特定识别序列序列，这种改变特异性称为星活性。16基因工程原理dna分子的切割与连接第16页限制片段数量和大小某个限制酶所产生片段数量和大小是由DNA中其靶序列出现频率决定。44(256)46(4096)48(65536)一些限制性内切酶在切割时表现出对同一DNA分子中一些位点有偏爱性。17基因工程原理dna分子的切割与连接第17页18基因工程原理dna分子的切割与连接第18页切割和连接DNA分子各种情况两个DNA片段进行连接，并不一定要求它们是由同一个限制性内切酶所产生。经过填补限制性内切酶所产生粘性末端，然后把产物连接起来，能够形成新限制位点。19基因工程原理dna分子的切割与连接第19页20基因工程原理dna分子的切割与连接第20页大肠杆菌Dam和Dcm甲基化酶试验室里大个别大肠杆菌菌株含有3个位点特异DNA甲基化酶。由dam基因编码甲基化酶由dcm基因编码甲基化酶在GC含量50%DNA中，这两种酶甲基化位点出现频率是256-512bp一次。M.EcoKI,每8kb出现一次。基因工程原理dna分子的切割与连接第21页消除大肠杆菌重组分子宿主菌株中限制系统有主要意义K限制缺点性大肠杆菌菌株K12大肠杆菌中全部限制系统都集中在一个长约14kb迁移控制区内。基因工程原理dna分子的切割与连接第22页酶质量控制基因工程原理dna分子的切割与连接第23页怎样选择限制性内切酶单酶切双酶切NEBcutterV2.0，选择酶切位点24DoubleDigestFinderNEBEnzymeFinder基因工程原理dna分子的切割与连接第24页经典酶切体系25基因工程原理dna分子的切割与连接第25页酶：冰箱取出后，放冰上；最终加到反应体系;混匀；每微克DNA用5-10unit酶DNA：不含酚、氯仿、EDTA、盐Buffer:1*反应体系：50

µlfor1µg底物反应时间：通常1h终止：终止液、纯化DNA26基因工程原理dna分子的切割与连接第26页限制性内切酶影响原因及优化离子浓度温度蛋白浓度酶本身优异性星活性（Staractivity）:在次理想条件下,一些限制性内切酶特异型会被降低,只有个别正常识别位置被识别,此称为第二活性（SecondaryActivity），也称星活性（StarActivity），加以“*”表示，如EcoRI*。严重时可造成切割完全紊乱。基因工程原理dna分子的切割与连接第27页DNA分子连接基因工程原理dna分子的切割与连接第28页亚克隆过程基因工程原理dna分子的切割与连接第29页体外连接DNA3种方法使用DNA连接酶，粘性末端T4连接酶，平末端末端脱氧转移酶，末端合成同聚3’单链尾巴基因工程原理dna分子的切割与连接第30页DNA连接酶31基因工程原理dna分子的切割与连接第31页利用DNA连接酶构建重组质粒32基因工程原理dna分子的切割与连接第32页应用碱性磷酸酶处理预防载体自连33基因工程原理dna分子的切割与连接第33页34基因工程原理dna分子的切割与连接第34页Adaptor使用35基因工程原理dna分子的切割与连接第35页基因工程原理dna分子的切割与连接第36页LigationProtocolwithT4DNALigaseSetupthefollowingreactioninamicrocentrifugetubeonice.

(T4DNALigaseshouldbeaddedlast.Notethatthetableshowsaligationusingamolarratioof1:3vectortoinsertfortheindicatedDNAsizes.)

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NEBioCalculator

tocalculatemolarratios.37基因工程原理dna分子的切割与连接第37页Gentlymixthereactionbypipettingupanddownandmicrofugebriefly.Forcohesive(sticky)ends,incubateat16°Covernightorroomtemperaturefor10minutes.Forbluntendsorsinglebaseoverhangs,incubateat16°Covernightorroomtemperaturefor2hours

(alternatively,highconcentrationT4DNALigasecanbeusedina10minuteligation).Chilloniceandtransform1-5μlofthereactioninto50μlcompetentcells.38基因工程原理dna分子的切割与连接第38页同聚加尾基因工程原理dna分子的切割与连接第39页PCR产物T-A克隆基因工程原理dna分子的切割与连接第40页引物引入酶