细胞信号转导研究方法详解演示文稿

细胞信号转导研究方法详解演示文稿目前一页\总数六十六页\编于十九点（优选）细胞信号转导研究方法目前二页\总数六十六页\编于十九点低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温度：4、-20还是-80，特殊要液氮冻溶：-20或-80→4（一天）→室温均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选择含目标蛋白高的组织）目前三页\总数六十六页\编于十九点步骤及注意事项：1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积）2、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔1min3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；人工匀浆4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶抑制剂价格昂贵）6、低温高速或超速离心7、超声的方法目前四页\总数六十六页\编于十九点细胞破碎与分离破碎方法：机械法：非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解常用：溶菌酶、β-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等；缺点：价格高，通用性差目前五页\总数六十六页\编于十九点化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（SDS、TritonX-100）、金属螯合剂（EDTA）、变性剂（尿素）微波加热法：适用于热稳定的产物其他：反复冻融法、渗透压法、干燥法目前六页\总数六十六页\编于十九点信号转导的研究方法受体

突变株的筛选（遗传学方法）受体提纯（亲和层析）标记配体法检测受体：

目前七页\总数六十六页\编于十九点受体与配体相互作用研究方法：（1）饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和力（K）以及结合位点的密度（Bmax）；（2）抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体的亲和力（Ki）；（3）动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结合速率常数（K+1）和解离速率常数（k-1）。目前八页\总数六十六页\编于十九点饱和实验

常用于确定受体密度（受体的数目）在实验干预（如药物治疗）时的变化。保持受体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中可估计受体最大结合量（Bmax）和受体对放射性配体的解离常数（Ka）。饱和实验的结果以结合配体数（与受体结合的放射性配体的浓度）为y轴，游离配体数（未与受体结合的放射性配体的浓度）为x轴作图。当放射性配体浓度增大时结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增多放射性配体量也不引起结合配体数的显著增加。饱和曲线的最高趋近点所对应的y值，亦可代表所研究组织中的受体密度。Kd为占据受体50％结合位点时的配体浓度。

目前九页\总数六十六页\编于十九点亲和标记法分离表面受体亲和标记（affinitylabeling）是常用的分离细胞表面受体的方法原理：将细胞与超量标记的激素（配体）混合，以饱和所有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交联。目前十页\总数六十六页\编于十九点亲和标记胰岛素受体目前十一页\总数六十六页\编于十九点大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基团，当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配体就会被交联在一起。与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的处理。因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电泳进行分析。目前十二页\总数六十六页\编于十九点交联剂的分子结构及与受体和配体的共价交联与自由氨基反应的位点目前十三页\总数六十六页\编于十九点核受体作用的DNA元件研究方法ChiponChip纯化的受体制备抗体→CHIP→特异核酸序列与已知序列的基因芯片杂交→受体结合的核酸序列目前十四页\总数六十六页\编于十九点G蛋白药理学激活剂及抑制剂非水解的GTP类似物激活剂：γ-S-GTP、β,γ-亚氨基GTP，与活化G蛋白混合，使G蛋白持续活化状态细菌毒素-霍乱毒素激活剂：ADP核糖基共价结合α亚基，不可逆修饰，结合GTP，但不能水解GDP类似物抑制剂：GDPβS，结合α亚基的鸟苷酸位点，广泛应用目前十五页\总数六十六页\编于十九点生化实验检测GTP结合实验：用GTP类似物[γ-32P]GTP，检测G蛋白的存在，几种G蛋白的特异性？免疫印迹实验：抗体GTPase活性实验：不同反应底物：同位素标记法（[γ-32P]GTP）；级联反应荧光法（NADH，GTPase、丙酮酸激酶和LDH）分子遗传学手段借助G蛋白突变株（功能缺失突变株、显性负突变株、功能获得突变株）目前十六页\总数六十六页\编于十九点环核苷酸信使系统cAMP/cGMP定性及定量测定

3H/125I标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统酶联免疫方法（ELISA)色谱分离-质谱测定细胞内实时测定：荧光共振能量转移（FRET）及生物分子荧光互补（BIFC）目前十七页\总数六十六页\编于十九点cAMP［3H］分析系统，优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；cAMP［125I］分析系统，用于小量样品的分析；cAMPELISA测定方法，测定简便、敏感性高（特异受体）。目前十八页\总数六十六页\编于十九点cAMP信号系统常用药理学试剂cAMP类似物：竞争性结合PKA调节亚基上的cAMP结合位点，PKA的竞争拮抗剂，PDE不能水解，Rp-cAMP、Sp-CAMP与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：结合C亚基的ATP结合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5720蛋白激酶抑制剂（PKI）：结合C亚基的底物结合位点，细胞内源：α、β、γ三种亚型，人工合成PKA抑制肽（高浓度时对PKG的影响）目前十九页\总数六十六页\编于十九点cGMP信号系统常用药理学试剂

人工合成的cGMP类似物：8-Br-cGMP，直接激活PKGsGC抑制剂：NS2028PKG抑制剂：KT5823目前二十页\总数六十六页\编于十九点脂质代谢的常用方法同位素示踪：通过标记32P磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用脂组学目前二十一页\总数六十六页\编于十九点DAG的测定

提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量（Amersham公司生产的DAG分析系统）。目前二十二页\总数六十六页\编于十九点IP3的测定

采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。D-myo-IP3［3H］分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感（Amersham公司）。目前二十三页\总数六十六页\编于十九点钙信号细胞内游离钙离子测定方法方法选择：1、使用Ca2+特异性指示剂时，指示剂与Ca2+专一结合性强、亲和力高，可以测定低浓度Ca2+；2、尽可能获得Ca2+浓度绝对值；3、测定Ca2+水平的变化比细胞内Ca信号引起的相关生理反应要快；4、指示剂与Ca2+结合不损害细胞内正常生理生化过程；5、容易进入细胞并在胞质内扩散；6、有可能显示胞内Ca2+分布。目前二十四页\总数六十六页\编于十九点［Ca2+］i的测定细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前二十五页\总数六十六页\编于十九点荧光法水母发光蛋白法钙离子荧光探针法（目前常用），标记靶细胞钙离子荧光探针

常用的有Fluo-3AM、quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。目前二十六页\总数六十六页\编于十九点荧光探针的装载方法：显微注射：水母发光蛋白和Dextran偶联的探针酸化导入法：离子型探针（有些细胞无法导入）常温孵育法：AM酯化的探针（在动物细胞应用广泛）低温导入法：植物细胞，低温抑制细胞壁的酯酶目前二十七页\总数六十六页\编于十九点荧光测定仪器

荧光分光光度计：少用流式细胞仪：激光扫描共聚焦显微镜术（LSCM）数字共聚焦显微镜目前二十八页\总数六十六页\编于十九点Fluo3若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与钙离子Ca2+结合后荧光会增加60至80倍，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。是目前最常用的一种钙离子荧光探针。Fluo3-AM是Fluo3的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。Fluo3-AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo3，从而被滞留在细胞内。激光共聚焦荧光显微镜具有氩激光器，所以Fluo3可被广泛使用于这种显微镜上。这种荧光信号发出来的长波也便于减小对样品细胞的光损伤。目前二十九页\总数六十六页\编于十九点钙调素的定量测定

酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测定CaM的总量，非活性）目前三十页\总数六十六页\编于十九点磷酸化的信号转导分子酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS电泳，然而采用Westernblotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。目前三十一页\总数六十六页\编于十九点免疫学法蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化流式细胞术：荧光抗体目前三十二页\总数六十六页\编于十九点磷酸化蛋白组学

高分辨率质谱磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）目前三十三页\总数六十六页\编于十九点激酶活性的测定

常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的活性。PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。目前三十四页\总数六十六页\编于十九点蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平及分子量检测westernblotanalysis信号蛋白分子在细胞内定位研究immunohistochemistry/immunnocytochemistryImmunofluorescence（IF）Greenfluorescentprotein（GFP，livecells）目前三十五页\总数六十六页\编于十九点westernblotSDS→转膜（PVDForNC）→封闭→一抗→洗涤→标记二抗→洗涤→显色或化学发光显影目前三十六页\总数六十六页\编于十九点SDS作用：确定蛋白质纯度、确定蛋白质亚单位的分子量考染：检测含0.1ug蛋白质条带银染：灵敏度高100倍目前三十七页\总数六十六页\编于十九点印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜氨基黑染色：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：50ng）考染：除NC膜外（50ng）丽春红S：适用印迹膜用于二次检测（westernblot）（200ng），条件摸索成熟后，不建议染色胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记目前三十八页\总数六十六页\编于十九点检测目标蛋白：

结合PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测1-5ng、中等分子量的靶蛋白上样量：目标蛋白量不应太低膜的选择：蛋白质的分子量（孔径）封闭液：20%BSA→10%脱脂奶粉→10%马血清

抗体：内参检测系统：辣根过氧化物酶-ECL结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低Strippingbuffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用目前三十九页\总数六十六页\编于十九点免疫荧光技术

Immunofluorescence（IF）利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光的激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测两种不同的分子（DoubleIF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子检测。目前四十页\总数六十六页\编于十九点蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术Co-IP（免疫共沉淀)GSTpulldownassayYeastormammaliantwohybridassayFRET（fluorescenceresonanceenergytransferassay)目前四十一页\总数六十六页\编于十九点IP是利用抗原蛋白质与抗体的特异结合以及细菌蛋白“proteinA”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段而开发出来的方法。目前多用精制的proteinA预先结合固化在agarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proteinA就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。AgarosebeadsproteinA抗原抗体目前四十二页\总数六十六页\编于十九点免疫共沉淀（Co-IP）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在胞内结合的蛋白y也能被沉淀下来。进一步通过westernblot和质谱分析。常用于测定两种目标蛋白在胞内是否结合用于确定一种特定蛋白的新的作用搭档但可能测定不到低亲和力和瞬间的蛋白-蛋白相互作用。目前四十三页\总数六十六页\编于十九点优点：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果。

目前四十四页\总数六十六页\编于十九点注意的问题：

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

（3）使用对照抗体：

目前四十五页\总数六十六页\编于十九点染色体免疫共沉淀技术（ChIP）

染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：目前四十六页\总数六十六页\编于十九点Chip-on-chipChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。目前四十七页\总数六十六页\编于十九点细胞核转录因子电泳迁移率改变分析:根据核转录因子可与一些特定的核苷酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，来鉴定信号转导中的核转录因子。并且采用足迹法(footprinting)分析新发现核转录因子结合DNA的位置和核苷酸序列。Chip目前四十八页\总数六十六页\编于十九点采用基因克隆技术发现了越来越多的信号蛋白分子；嵌合分子的构建及基因转染等技术的应用为细胞因子的信号转导研究提供了有效的手段；点突变、肽竞争等技术使信号蛋白中某些功能区的作用的研究变得更为精确。目前四十九页\总数六十六页\编于十九点细胞信号转导与疾病目前五十页\总数六十六页\编于十九点信号转导异常发生的环节和机制

一．信息分子异常不足：如胰岛素生成减少，体内产生抗胰岛素抗体或胰岛素拮抗因子等，均可导致胰岛素的相对或绝对不足，引起高血糖。过量：脑缺血、缺氧或创伤时谷氨酸释放增加，各氨酸在脑内大量聚集。导致谷氨酸／天冬氨酸受体(NMDA受体)的过度激活。使Ca2+大量内流，可激活脂酶和蛋白酶等，导致细胞死亡。（由谷氨酸增多对神经系统产生的兴奋性毒性作用：脑的缺血性损伤，癫痫形成以及神经退行性变等）。目前五十一页\总数六十六页\编于十九点病理性或损伤性刺激

病原体及其产物的刺激：如脂多糖(Lps)通过其受体启动细胞的信号转导通路：a.激活转录因子NF-κВ；b.激活MAPK家族成员：JNK和P38MAPK。目前五十二页\总数六十六页\编于十九点1、遗传性受体病受体缺陷导致的疾病：

如家族性肾性尿崩症是ADH受体基因突变导致ADH受体合成减少或结构异常。受体过度激活导致的疾病：TSHR与TSH结合后。能激活Gα-AC-cAMP-PKA通路、Gq—PLC—DAG—PKC通路及ERK通路等，导致甲状腺紊分泌和促进甲状腺增殖效应。

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二、受体信号转导异常目前五十三页\总数六十六页\编于十九点2、自身免疫性受体病：Grave病，重症肌无力患者体内发现有抗N型乙酰胆碱受体(nAChR的抗体）．能阻断运动终板上的nAChR与乙酰胆碱结合，导致肌肉收缩障碍。

3、继发性受体异常：心衰时血中去甲肾上腺素浓度过高可使受体下调以及受体与G蛋白解偶联，使细胞内cAMP生成减少，导致去甲肾上腺素的正性肌力作用减弱．二、受体信号转导异常目前五十四页\总数六十六页\编于十九点

如霍乱肠毒素能选择性催化小肠黏膜上皮细胞中的Gα亚基精氨酸ADP核糖基化，导致GTP酶活性丧失．使Gα处于不可逆性激活状态，持续刺激腺苷酸环化酶(Ac)-cAMP-PKA，使水分不断进入肠腔，引起严重的腹泻和脱水。三、G蛋白信号转导异常如在组织缺血-再灌注损伤过程中，胞浆Ca2+浓度升高，通过下游的信号转导途径引起组织损伤。四、细胞内信号的转导异常

目前五十五页\总数六十六页\编于十九点在疾病的发生和发展过程中，可涉及多个信息分子影响多个信号转导途径，导致复杂的网络调节失衡。五、多个环节细胞信号转导异常如感染性休克发病过程中，在同一刺激源（内毒素）作用下使交感神经兴奋，若作用于α受体，则引起动脉收缩表现为冷休克;若交感神经兴奋激活β受体，使动、静脉短路开放，则表现为暖休克。如心肌肥大的发病过程中，心肌负荷过重引起的机械刺激，神经体液调节产生的去甲肾上腺素、血管紧张素等，通过不同的信号转导蛋白的传递，最终引起相同的病理反应—心肌肥大。六、同一刺激引起不同的病理反应七、不同刺激引起相同的病理反应目前五十六页\总数六十六页\编于十九点某些疾病的异常信号转导胰岛素受体(IR)为酪氨酸蛋白激酶(PTK)型受体。PTK激活．通过胰岛素受体底物(IRS)激活PI一3K及Ras—Raf一MEK—ERK等多条信号转导通路，①促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位到膜上，从而增加外周组织摄取葡萄糖的能力；②使无恬性的糖原合酶转为激括的形式．增加糖原的合成；③使基因表达增强．蛋白质合成增加、促进细胞的增殖等。一、胰岛素抵抗性糖尿病目前五十七页\总数六十六页\编于十九点1、遗传性胰岛素抵抗性糖尿病一般有家族史，已报道了发生在该病患者中约50多种胰岛索受体的基因突变，突变呈明显的异质性，以点突变为主，分布于受体的胞外区和PTK区。突变可导致受体合成障碍、受体往细胞膜运输受阻、受体与胰岛素亲和力下降、PTK活性降低及受体降解加快等。目前五十八页\总数六十六页\编于十九点2、自身免疫性胰岛素抵抗性糖尿病患者多为女性，合并其他自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮等。血中可测到抗胰岛素受体的抗体．以阻断型为主，与受体结合后可阻断胰岛素与受体的结合及效应。

目前五十九页\总数六十六页\编于十九点3、继发性胰岛素抵抗肥胖患者通常摄人过量，使餐后血糖浓度明显增高，进而引起血中胰岛素浓度升高，长时间增高的胰岛素可通过下调作用使IR减少，导致靶细胞对胰岛素的敏感性降低．严重的创伤、应激、感染时，大量产生的应激激素(如糖皮质激素)和细胞因子(如TNF—α)等可通过干扰胰岛素受体后的信号转导途径及细胞内的代谢高血糖和运动不足等也可引起胰岛素抵抗