利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程摘要：本研究对香菇在273K、283K和293K条件下密闭容器中的氧气和二氧化碳随时间浓度变化进行了测定，通过酶动力学原理和利用非线性估计法、多重回归分析分别获得气体成分的变化率曲线和米式方程，从而获得相应参数，求得反映呼吸状态的呼吸熵动态变化规律以及温度影响参数—活化能，这样就可以求出在任意温度、有氧呼吸气体环境条件下果蔬的最大呼吸速率，为气调包装系统设计提供必要依据。关键字：酶动力学原理非线性估计法多重回归法米氏方程呼吸熵活化能香菇Lentinasedodes(Berk)sing，又叫香菌、冬菇，属白蘑（口蘑）科香菇属，为食用菌类蔬菜，在蔬菜中属于呼吸强度较大的一类品种。植物活体的呼吸总方程式为：植物体贮藏环境中氧气以及二氧化碳含量直接影响到植物体的新陈代谢，呼吸速度越快消耗体内的糖分等物质就越多,鲜度下降就越快。植物的有氧呼吸涵盖了一系列的酶催化反应，其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通过三羧酸（TCA）循环获得产物CO2[1]。因此，有效的气调包装能抑制香菇的呼吸速率及新陈代谢作用，延缓衰老达到保鲜的效果。呼吸强度是设计气调包装方案的重要指标参数，影响呼吸强度的因素有许多，如温度、湿度、二氧化碳浓度、氧气浓度和时间等。这些参数将为包装膜透气率的计算和选择提供理论基础。本研究延承了Leeetal.（1991）[2]的三维参数模型—时间（t）、氧气浓度（O2%）和二氧化碳浓度（CO2%）浓度之间的相互关系，建立酶动力学方程即Michaelis-Menten方程，同时考虑三种参数影响，得到香菇呼吸模型，为气调包装参数的选择提供理论基础[3]。1材料与方法1.1材料香菇采购于上海杨浦区渭南路农贸市场，选取菇型圆整、菇柄正中、不开伞，卷边整齐，无病斑的香菇为实验材料，并进行清洗、沥干处理，实验前将香菇在预设的三种温度（293K、283K和273K）下贮藏5个小时直至达到实验所需温度。1.2仪器103层析仪[色谱柱为：Porapak-Q柱（60~80目）+13X（60~80目）：上海仪器厂1.3主要实验方法1.3.1密闭实验设置实验通过初始条件即O2：21%；CO2：0.0%，将一定质量的香菇放于一定体积的玻璃容器中，瓶底装入干燥剂（一定量的硅胶和CaCl2（s））以控制体系湿度，因为湿度会影响到贮藏样品的水分活度，水分活度的大小直接影响到生物体代谢快慢，这就会对体系氧气和二氧化碳的浓度变化有较大影响[4]。其次，将瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后（橡皮塞上有一φ8mm的小孔，用φ15mm×5的硅胶垫密封），置于一定的水浴或冰浴中待温度恒定，然后每隔0.5-1.0小时用注射器量取0.5mL气体成分注入层析仪进行检测,平行检测两次，同时记录下O2、CO2对应检测的峰高，计算出对应体系中的百分含量。层析仪中参数设置为载气：99.995%N2；流速15mL/min；柱温：40℃；检测器：TCD，温度：80℃；进样温度：40℃；定量方法：外标法。每组实验的设置见表1：表1香菇呼吸密闭体系环境设置Table1Thedesignofclosedsystemmethodofthreedifferenttemperatures返温度能（角K袋）迅273禽283牲293好香菇质量帐（悠g堂）碌180.吧9熄295植281.选6彻容器体积筝（辉L式）颠1述2济2末空隙体朝（茫L废）隐1.22寻0.89猎0.75锋处理条件踢冰浴份恒温水浴帖恒温水浴1.3.2密闭容器中的呼吸速率方程的拟定由于各类蔬菜的品种和个体差异较大，呼吸环境中氧气、二氧化碳浓度随时间的变化也千差万别，所以历来文献都没有参照统一的方程来描述气体浓度随时间的变化。依据米氏方程的Lineveaver-burk曲线图可知呼吸化学方程在初始阶段反应速度维持恒定即呈线性，但随着时间的增长，曲线的斜率变化速度减少，反应速度趋向一恒定值，因此，简单的直线方程并不能真正地表达浓度与时间的关系，气体浓度随时间变化的曲线呈弧线形，并无限趋近一定值，将所有的参变量（rO2，rCO2）和应变量（[O2]，[CO2]）同时表示成时间（t）的函数，通过上述推论以及结合STATISTICS软件中的非线形估计法[5]（NonlinearEstimation），选取损失函数（L）值最小（损失函数（L）=（观察值（OBS）-预测值（PRED））2），复相关系数(MultipleR)接近于1的公式作为反映不同温度下香菇在密闭容器中气体浓度与时间的关系式：[1][2]其中，氧气和二氧化碳的浓度（[O2]，[CO2]）以百分数%表示，时间t以小时（hr）计算。因此，根据式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt：[3][4]椒则呼吸速涉率为：[5][6]晓式中烟，剪r指—预呼吸速率飘（氧气的镜消耗率或暂二氧化碳榨的产生率取）裳（衣mg/k廊g咐﹒盯h拘r络）；迈M凉O2/C爱O2参—够氧气或二互氧化碳的盯摩尔质量采（菠g/mo允l种）；隐V疲—旺空隙体积焦，桐L伪；唐W骂—桑密闭体系码中香菇的隐重量估，虫g淋；班P必—裹体系压强农（阴P告a叹）；恰R写—鲜理想气体怨常数宏（拐8.31闸4J/m墨o厉l讯﹒盗K滩）；纽T臭—颠开氏温度茄（似K棒）。摘1.3.么3Mi粉chae剪lis-床Ment结e留n卧方程的确位立贴谨依据酶动麦力学呼吸上模型泳[4]萍要求体系懒保持有氧急呼吸状态后即涌[O婆2著]>1.嘱5韵%狡或额[CO河2门]<20置%挽才是有效弃的宿[6]映，氧气过袭低或二氧夹化碳过高丽将导致香阔菇无氧呼渔吸，则不鼓符合米氏居规律。在昂本次实验捧中同时测弃定了单位累时间内底隙物（氧气伯）的消耗损量以及产洞物（二氧梳化碳）的医生成量。烂其中二氧葛化碳又是舌化学反应清的非竞争坏性抑制剂受，因此，岁依据米氏窜方程的非忽竞争性作毙用的速度辆方程为如歌下公式：[7][8]惧式中飘，惜V唉m耳、掉K易m震和段K郑i坐—狱调整因子旷；苍V朽mi荣—吨最大反应豆速率（氧刃气消耗的希最大速率载或二氧化适碳产生的厌最大速率馋）夺（维mg/k卧g私﹒盛h膏r原）；女K斑mi鱼—束表观米氏拾常数从（键%酬）；洗K乔i恩—罪抑制系数脸（枝%友）。帅通过实验炼所测结果垦利寸用晓STAT锐ISTI砍C免A花软件进行锣多重线性促回归分析扭求得其值纸。举而脏r萄CO2/贡r苹O2嘱的值就是小呼吸熵糕（装R写Q轿）祖[7]钢，它是表叙现氧气与痒二氧化碳怜共同作用微下香菇呼岗吸状态的冬动态因子蜓，也是定麻性代谢途抵径以及表秒征脱羧酶驳或氧合酶桶系统的一因个有效参眯数。本次古实验中要辞求体系维依持在有氧籍呼吸状态严，所以通出过计算做，贵R而Q副应该小于叉或接近奴于叹1跪，辞即郑r井CO2墓≤盛r渗O2怨。协1.3.毕4鸦拜温度对香朋菇呼吸作侮用的影猜响补被氧气和二疑氧化碳的施变化率除椅了受浓度书、酶等因闹素的影响乖，最关键桑的是受到糠温度的影概响，在求悟得了不同叮温度下氧栽气和二氧劳化碳的最泡大变化率另（省V燕m鲜）后，通粪过情Arrh壶eniu今s突[8]催关系救将岔1/尖T容与委LnV鸭m热进行线性肃回归，其森斜率值禁为倚Ea/咽R牌，淘E玉a滩（既kJ/m腹o恋l珠）就是活克化能，由薪此可推算闸其他温度间下香菇呼臣吸作用的蓄最大呼吸穗速率，其卡预测方程岂为：[9]所式中盗，酿V或m0址—狼已知的氧远气最大消店耗率或二欧氧化碳的斯最大产出有率厉（蜓mg/k玩g速﹒无h雨r岛）；撇T孕0乡—汉已知的温浆度雷（握K鞠）；泛V谷m社—跳T难温度下的系氧气最大浆消耗率或率二氧化碳证的最大产冬出率妥（倾mg/k糕g档﹒组h主r荣）。假2亚结果与分玻析钓2.1响讯不同温度涝下香菇在荷密闭体系胁中气体浓甲度函数的中确定许各个温度辆下的氧气薯和二氧化轰碳随时间炒的变化的眨回归方程才见励表疲2住。例由跳表饲2解可以看出祥由实验数顷据拟合出晃的曲线有虹较好的吻议合性，从睁而得出各栏个温度下闷以时间为晌自变量，愿氧气与二测氧化碳浓寨度为应变散量的方程败式。牢表窄2傻侄氧气、二沫氧化碳浓论度随时间诉变化的非硬线性回归任方皇程棒Tabl肯e2左Nonl印inea素res抱tima炸tion删reg赌ress狼ion皇ofO浮2游,CO滨2夺chan睛gew裹ith缘time崇己温央度解K洲非线性回洒归估计方至程黎损失函数步（覆Los葵s购）咸复相关系秋数只（菠Mult棚iple邀跃R坊）佣293妇9.77商0.99彼3况3.56怪0.98策8隆283毫9.60辫0.98胞7指6.37付0.99里3须273泪10.8爪9衡0.98越7伶5.21滥0.96库3香2.2伸Mich瑞aeli但s-Me蹄nte迷n旦方程及各永参数的确赶立晴在求得了嘴各个温度济下氧气和羞二氧化碳职浓度与时意间的拟合赔方程后，淋就可以根患据公恭式渡[5]~笨[8击]姨，求得氧淡气的呼吸斜消耗速帝率疑r罗O2各和二氧化义碳的呼吸维生成速轻率着r姥CO2蜘，拟合曲坏线见凭图秤1宪；根据公较式吼[7日]朱、莲[8练]浸通过多重涝线性回归务分析，获彻得桶表手3唐结果：镰表序3偶曾香菇娃在青273视K猜、紫283较K私和霉293瞎K拥下根据多祝重回归求疗得米氏方遵程各参数秒值红Tabl静e3E束stim规ated盐val零ues焰for已Mich宗eali担s-Me禾nten艺mod掀elo豪fsh权iita企kei粱n27闻3K,2云83K蛾and五293K疤det诉ermi柜nedb维ymu则ltip轻lel匪inea赠rre仁gres爱sion康补温垄度许K左K杆m玻%O2竿V环max拳mg/k信g醒·四hr怨K仰i滔%CO2商R轰2才标准误差犹（留Std.董Erro矛r坡）量293第0.27厌981观1.33欣0.98遮5它0.00算59村0.23妄828呢1.58瓦0.98川5窝0.00赴0034框283雨0.4展743婚2.86卖0.98千9渗0.06协0宇0.14卖314洪8.20友0.98办9早0.00涛0038俘273希0.05酿117矿8.11偷0.97俗3处0.22先0.01雹7较57.4恨23.5都8奉0.97叮3丢0.00恼015通注争：批2莲、镜4渐、璃6洞行数据由规公朋式饥[7挣]获求得紧，盗3墨、徐5纯、粉7堤行由公忧式唤[8弯]疮求得。壤表票3励中，每组皱方程各项奸的标准回观归化系数晓（饲BET笛A势）在软件忧中显示高帆亮度（于即砖P-le饥vel<滥0.0忠5杏）说明线付性显著。映在袋293啄K碧条件下，款香菇的由公始至终呼择吸熵介在寨0.86嘴~1.0抚2妖之间变化条，其中，浸当氧气浓忆度录在恼1.0贺%烛和二氧化耳碳浓度嘉在爸13.4失%洪条件下呼素吸熵约槐为抚1黄；弃在午283呆K声条件下，船香菇的呼违吸熵响在侮0.4~名1.善6欧之间变化宰，当氧气士浓度剧为方5.2泳%嘉和二氧化鞠碳浓度多为且7.2赴%闪，雾R猫Q舅约平为卫1踪；抓273锣K望条件出下崖R苦Q符区间攀为念0.4~考1.0完3某，当氧气庸浓度俩为差0.7沿%沃和二氧化洋碳浓度她为魄8.4或%妖，怖R阻Q蹄约裳为丰1魔。由此表牙明本实验脆是在有氧垄呼吸的条之件下进行悄的，计算扮有效。港2.3贴窄温度对香齿菇呼吸作锅用的影响绩三个温度恳下拆LnV彼m话的值统计纹见碌表惯4惩：啄表节4蹈斯不头同叠1/和T腔下浸，犯LnV仿m呢丽的句值肝Tabl门e4诚The精valu馋eso拾fLn寄Vmi忧ndi裂ffer门ent照1/T让1握/混温度数（群K虽）佛1/27愚3朗1/28家3凳1/29潜3卷LnV蓬m1拣4.76塑6.61药6.89域LnV失m2丛4.05仗5.75勒6.72刚不框同偶1/支T饥下浸，绵LnV飘m娇线性回归维预测值与扯观察值关眼系中氧气鱼斜桐率鹿=-0.贡9烘3瘦，复相关鉴系烘数卵=0.9瞒2倡7赠；二氧化日碳斜荡率灶=0.9岔9酒，复相关道系舅数箱=0.9确9际0晕。秃通过计算鄙求得的在型氧气最大枝消耗率活烦化能僵为扑7.73露kJ/m碍o吉l怒；二氧化拘碳最大产拐生率的活酿化能障为河8.23却kJ/m题o芳l有。根据公乘式感[9据]但，在已知刷一定温度盾下氧气的搞最大消耗掏速率或二欲氧化碳的白最大产出挽率，就可咱以求得其脑他温度条缠件下的最监大变化率牵。例如：炊在有氧呼慈吸条件下牺，已知香在菇帽在午273秃K千下氧气的虏最大消耗翁率逃为聋117m饮g/k扩g渗·由h誓r飞，根据公薯式塌[9述]窜代入相关村参数值可但求得印在输288见K托下氧气最朴大消耗率缝为飘139.蛮7mg倾/k问g洁·餐h手r此。线3肿结果与讨幻论鸡本次实验速利用米氏继方程机理绑，选取了躁具有一定剧特征的函浪数形式，誉拟合了一谈定温度下陕氧气、二兔氧化碳浓抽度随时间瓜变化的方级程，并且才复相关系裤数都达到唇了净0.9浸5食以上。砖米氏方程刑的各个参拢数值为进东一步气调表包装的参千数设定提捕供理论依挥据，并且景方程原始淡模型仍为诵时间的函缺数，大大答简化了由舒于呼吸作禾用而导致摆体系的复酱杂性。实倒验中同时彩也获得了报对呼吸熵药的动态变算化。进温度因子它对香菇呼蜡吸作用的跟影响则通葵过须Arrh免eniu台s吸关系求蕉得薄E弱a练，同时求乌得在有氧律条件下不且同温度下冒的氧气的恐最大消耗玩率或二氧挠化碳的最案大产出率镰，为以后孔在不同温底度下进行损气调包装昨提供数值蜓参考。参考文献底[1]良课罗纪盛、龙张丽萍、互杨建雄皇等舍.孟生物化学禁简明教温程坊[M]肉.悼北京：高浴等教育出砌版社宇，肠200恩0吴：赢159~兰176占[2]D罩.S.L梁ee,P标.C.H忆agge固r,J.角Lee,汗and立K.L胃.Yam满.Mod涂elf德orF程resh税Pro乱cuce帽Res情pira大tion腰inM萝odif汽ied对Atmo惧sphe疤res域Base底don片Prin遥cipl红eso嘴fEn术zyme茶Kin骄etic棉s[J]震.J.显Food梯Sci梦.199初1军，土56(6兆)耳：奔1580枝~158夹5稼[3]装违刘颖，李束云飞，王土如竹，田未平海，杨航宏牛顺趋.睁基立于贷Mich危aeli景s-Me致nte醒n此型呼吸速抢率的实验酱研撒究宏.尾上海交通纸大学学报锦，久200殊4答，栋3三8帐（葬7督）丑：艰1170膜~117概3龙[4]炉Yoon伪seok过Song规,Don尊gSu柔nLe它ean段dKi哄tl.Y侵am.P哀redi慰ctin量gre粪lati锦veh车umid碗ity墨inm丘odif份i