RIP实验技术要点

【实验技巧】RIP实验技术RIP实验技术导语近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。下面我们来介绍一下RIP技术。

RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNAimmunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。

在RIP试剂盒（如Sigma的Imprint®RNAImmunoprecipitationkit）的帮助下，研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据ActiveMotif公司产品经理KyleHondorp介绍，该公司的RNAChIP-IT®kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAseI处理，最后利用磁珠进行沉淀。“如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”生产MagnaRIP™RNA-bindingproteinimmunoprecipitationkit的EMDMillipore公司，也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。除RIP以外，CLIP（UVcrosslinkingandimmunoprecipitation）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP技术——iCLIP（individual-nucleotideresolutionCLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。据伦敦大学学院的JernejUle教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。“CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。”一.细胞裂解液获取A.单层细胞或者贴壁细胞处理1.冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次2.加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管3.1500rpm，4℃4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min5.每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80B.悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解C.组织样品处理1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次2.加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数3.1500rpm，4℃4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min5.每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80二.磁珠的准备A.实验前准备1、enpendoff管2、磁力架3、冰盒，RIPWashBuffer置于冰上4、抗体，置于冰上5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水B.磁珠准备过程1.重悬磁珠2.标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3.吸取50μl重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管4.每管加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡5.将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次6.用100μl的RIPWashBuffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中7.室温孵育30min8.将enpendoff管置于磁力架上，弃上清9.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次10.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后置于冰上三.RNA结合蛋白免疫沉淀A.准备工作1、冰盒2、360°旋转仪3、RIPWashBuffer、0.5MEDTA、RNaseInhibitor置于冰上常见的用realtimeqRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用input作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话，那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR，用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使