药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析

药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析第一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一抗体

---生物体自造的“magicbullet”医疗

直接或与毒素连结攻击

病变細胞研究

各种免疫分析第二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一抗体药物销售趋势图第三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一国际抗体药物2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，世界范围内的单抗药物销份额约是整个生物制药市场份额的36%。第四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一国内抗体药物目前我国的上市抗体品种中,国外进口单抗占据多数2011年国内市场规模超过10亿元我国抗体药物产业化的主要限制因素：动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓QbD（质量源于设计）理念的应用第五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一抗体偶联药物(AntibodyDrugConjugates，ADC)结合单克隆抗体的靶

向性和小分子药物的

高度细胞毒性，可以

有效地杀伤肿瘤细胞，

在临床前研究、甚至人体临床研究中，取得了良好的抗肿瘤效果，成为生物药物研究的热点领域之一;ADC药物为疾病的“精准医疗”提供有效的武器。抗体-药物偶联剂（ADCs）的研究进展与产业现状:/master/liuboning/584302.shtml第六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Antibodyandstructure特点：2个基因决定一个蛋白质与抗原的结合力强，高度专一性第七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一抗原和抗原决定簇一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇每個抗原决定簇至少誘生一种专一性抗体蛋白质抗原的决定簇含有六个以上氨基酸第八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

。

第九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一克隆选择

学说第十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一单抗和多抗多克隆抗体（polyclonalantibody）指由不同B细胞产生的针对多种抗原决定簇的多种抗体混合物，如免疫血清。单克隆抗体（monoclonalantibody）指由一种

B细胞生产，针对某一抗原决定簇的单一抗体。第十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Preparationofpolyclonalantibodies传统抗血清抗原免疫混合抗体123412341234免疫前要先把抗原作成乳剂约在两月內注射五到八次第十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Preparationofmonoclonalantibodies第十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Preparationofrecombinantantibodies淋巴细胞总RNA抗体轻、重链文库重组单链抗体基因轻、重单链基因大肠杆菌表达体系单链抗体第十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一单链抗体在重链与轻链之间加上一段连接肽，连成一条单链如果仅是两条链的可变区，称为ScFv连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是GGGGS×3第十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗针对一抗的物种特异性ProteinA针对所有动物抗体Fc第十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一ImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

第十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一抗体的标记方法放射性同位素标记酶标记荧光标记有机分子荧光标记绿色荧光蛋白标记稀土荧光标记通用标记第十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一放射性碘标记第十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一HRP酶标记简单化学偶联方法：

1．过碘酸钠法：

仅用于HRP的标记。HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，再与抗体蛋白的游离氨基结合，结合反应后，再加人硼氢化钠(NaHB4)还原后，形成稳定的HRP—CH2—NH—IgG酶标记物。为防止酶蛋白氨基与醛基反应发生自身偶联，常在标记前知用二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白上的α和ε氨基。

2．戊二醛交联标记法：

戊二醛具有两个活性醛基，分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。NaHB4HRP第二十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一LabelingwithisoFITC第二十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一GFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc第二十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一通用标记+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAb第二十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一ImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—competentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA第二十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一ImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor第二十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一组织切片或培养细胞单层细胞/组织固定免疫染色（荧光）显微镜观察第二十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一免疫荧光标记的c-Mycphalloidin荧光标记的微丝荧光染色的细胞核合成图像第二十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Immunoblot---WesternBlot第二十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一ElectroblottinggelPVDFmembrane第二十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Immunostaining封闭分析抗体显色抗体显色数字化灰度图像分析第三十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一0.51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1Actin第三十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一CaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotin第三十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一RIAAssay第三十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一免疫竞争结合分析---小分子抗原分析的基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性计数第三十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一常用分离沉淀技术盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠聚乙二醇法（w=6000）特点：快速，价廉，来源方便，受环境影响大抗体免疫沉淀法特点：分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高固相吸附剂第三十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一RIA测量步骤恒量的*Ag、Ab加入反应管中加入待测样品、或标准品（已知浓度）37℃或4℃温育加入分离剂分离结合及游离部分测定以总放射性为分母，测定*AgAb为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度第三十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第三十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一Calibrationcurve第三十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）第三十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一SandwichELISA竞争法（略）第四十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一HighConvenienceHighSensitivity第四十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一96-wellplate包被封闭结合显色酶标仪测定hv洗涤洗涤洗涤终止第四十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一酶的底物

邻苯二胺(OPD)+H2O2

TMBABTSHRP的底物氧化产物(橙红色)492nm吸收2mol/L硫酸终止反应AP的底物硝基苯磷酸酯对硝基酚(黄色)NaOH终止反应

405nm吸收峰磷酸4-甲基伞酮（荧光底物）第四十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一荧光偏振免疫分析第四十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一PrincipleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipoleexcitationlightpolarizedalongzxzyIIdetector第四十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一FluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence第四十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一偏振度r第四十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一时间分辨荧光免疫分析第四十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0荧光背景和常用探针分子的荧光寿命第四十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一