免疫组化染色修改

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原一抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原一一抗一二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶一抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素一生物素一过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素一过氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用曰202和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

K-瓦牌旭含物FAPr'NarnpFrorDircctmethodO-坐物素BitJhiKXift生物意蚩白Avidin抗生物素皱白-生物素做令物AUC■捕L原K-瓦牌旭含物FAPr'NarnpFrorDircctmethodO-坐物素BitJhiKXift生物意蚩白Avidin抗生物素皱白-生物素做令物AUC■捕L原=1^^抗体Anti|(Mw|yQ我物LihdABC桂ABCmctlwd阿楼疏IndirftCIFTWllrodPAPJ±PAPtnediiwi图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）（图2）。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫组化染色技术。本实验室也采用SP法进行常规免疫组化染色。二、实验准备：标本准备（取材信息了解）石蜡包埋组织切片：石蜡包埋组织切片由病理室常规制备，具体流程见样本库相关文件。注意：实验前应充分了解组织的取材和处理过程，组织固定材料、固定方法、固定时间、石蜡包埋过程、切片批次、切片保存条件和保存时间都可影响实验结果。要确认临床诊断信息、切片HE报告和病人临床信息，明确所选切片是否可用。冰冻组织切片：由病理室常规处理。细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60%以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2h。试剂准备⑫抗体选择单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交，敏感性好。因此，在选择抗体应注意如下方面：（1） 一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书必须有IHC测试结果，如有免疫荧光测试结果更佳。（2） 查找该分子的相关文献报道，选择文献上常用的经典抗体，但是不能迷信文献，尤其是影响力较低的文献。临床诊断用抗体须选择政府部门批准用于诊断的抗体。（3） 注意抗体品牌的信誉，了解同行使用经验。（4） 了解抗体的克隆号和抗原肽序列，明确抗体的交叉反应性。（5） 一些极昂贵的低效价抗体可探索回收利用方法。二抗试剂盒目前本实验室所用二抗试剂盒为LifeTechnologiesHistostain-PlusKit（HRP,BroadSpectrum），货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB试剂盒目前本实验室所用为迈新加强型DAB显色试剂盒，货号DAB-2032。其他试剂二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES胶抗体特异性验证所有免疫组化抗体均须Westernblot验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。耗材准备免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片溶液配制磷酸盐缓冲液（PBS）10XPBS母液配制NaCl 72gNa2HPO4•12H2O 37.3gKH2PO4 4.3g加蒸馏水至1000ml,充分混匀贮存。使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。注意：PBS的pH值对抗体的结合力有很大影响，配制时须用酸度计精密测定并调整。调整pH值幅度过大会增加调整次数，导致溶液盐离子浓度升高。柠檬酸抗原修复液抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：称取柠檬酸10.5g,溶于500ml蒸馏水;称取Na2HPO4-12H2O57.3g,溶于800ml蒸馏水。分别量取358ml柠檬酸溶液和642mlNa2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至6.0,即得2X母液，贮存备用。1%盐酸酒精浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。免疫组化预实验预实验的目的在于探索实验条件和方法，直接决定后期实验结果，主要注意如下方面：（1） 最佳抗体稀释浓度设定：可根据抗体说明书来设定抗体稀释梯度，也可根据文献报道设置抗体稀释梯度，最终确定合适的抗体稀释浓度。（2） 抗原修复方法和修复液的选择：不同抗体不同组织可能有不同的修复方法，查阅相关文献，比较不同修复方法和修复液的差异。通过前期实验比较，本实验室常规采用柠檬酸高压修复法。（3） 显色方法选择：SP法显色有二步法和三步法，二步法较三步法操作简单，特异性较好，但敏感性不及三步法。因此临床诊断多用二步法，而科学实验常选择三步法。本实验室根据以往经验，常规采用三步法显色。（4）每次预实验均须设阳性对照和阴性对照，对于前次实验已经确定特异性的抗体，可只设阳性对照。三、免疫组化操作步骤烤片60°C烤片30min以上。组织片脱蜡水化将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15min。依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5min。依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5min。依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2min,取出。放入PBS的玻璃缸中清洗，重复3次。抗原修复将切片浸入1X柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2min，然后停止加热让切片自然冷却。注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！封闭内源性过氧化氢酶放入3%H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15min。放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5min。抗体杂交甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20pl（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28CM置20min，甩十。加稀释好的一抗1滴（20〜50m，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4°C过夜。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min,更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。加入生物素偶联的二抗20〜50似（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37C放置20min。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。显色加链亲和素一辣根过氧化物酶20〜50m（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28CM置5〜20min，甩十。置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。滴加新鲜配制的DAB工作液100俱（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时（约5min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次。注意：DAB显色5min即可达到平台期，之后延长显色时间并不能加深颜色，决定最终显色深浅的是一抗浓度。复染浸入苏木精溶液中复染，放置5min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化1—2s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2min。脱水、透明和封片依次放入95%、95%乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。滴加适量中性树胶，封片，晾十。注意事项①整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。②组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。四、结果判读判读结果前必须掌握目标组织的组织学和细胞学特点，选择正确的目标组织，才能对结果作出正确评价。阅片时应注意抗原的组织定位和细胞定位，比较不同组织、不同细胞之间的差异，以及同一组织不同细胞群的表达差异。阳性细胞判断DAB显色呈黄色。每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死、切片刀痕和组织切片边缘，这些边缘区域由于液体表面张力而具有较高的抗体浓度，因而着色较深，边缘着色不能视为阳性。为避免边缘效应，实验时液体应充分覆盖组织，至少超过边缘2mm，免疫组化笔圈组织应离边缘3mm以上，避免油剂的影响。组织前期处理和取材须规范，尽量避免坏死较