Cathepsin-B、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用

CathepsinB、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用

【摘要】目的:探讨肝细胞肝癌组织中组织蛋白酶B(CB)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体基因的表达、相互关系及作用，并分析其机制。方法:应用RT-PCR方法测定71例肝组织标本，包括对照组12例，HCC组34例和癌旁组织组25例的CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA表达，分析其间的相关性。结果:HCC组CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA表达均明显高于C组和PTT组，差异有显着性，PTT组与C组间差异均无显着性。CBmRNA与uPAmRNA，CBmRNA与uPARmRNA，uPAmRNA与uPARmRNA之间均存在显着的正相关关系。结论:肝癌组织CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA均呈现高表达，它们之间可能相互诱导，协同促使肝癌的侵袭和转移。

【关键词】癌肝细胞组织蛋白酶B尿纤溶酶原激活物尿纤溶酶原激活物受体

Expression，relationshipandeffectofgeneofcathepsinB，urokinase-typeplasminogenactivatoranditsreceptorinhepatocellularcarcinomaXUChang-long*，ZHENGJun-jie，XUEZhan-xiong，HUANGZhi-ming．*DepartmentofDigestiveMedicine，theSecondAffilatedHospitalofWenzhouMedicalCollege，Wenzhou，325027

Abstract:Objective:Todeterminetheexpression,relationshipandfunctionofgeneofcathepsinB(CB)，urokinase-typeplasminogenactivatoranditsreceptorinhepatocellularcarcinoma，andtoexploretheireffectsandmechanism.Methods:TheexpressionofCBmRNA，uPAmRNAanduPARmRNAin71specimensofhumanhepatictissue，includingcontrol(C)12，hepatocellularcarcinoma(HCC)34andparatumortissueofhepatocellularcarcinoma(PTT)25weredetectedwithreversetranscription-polymerasechainraction(RT-PCR).TheexpressionofrelationshipamongCBmRNA,uPAmRNAanduPARmRNAwereresearched.Results:TheCBmRNA,uPAmRNAanduPARmRNAinHCCwereverysignificantlyhigherthanthoseinCandinPTT；therehadnosignificantdifferencebetweenPTTandC(allP).ThereweresignificantcorrelationbetweentheexpressionofCBmRNAanduPAmRNA，CBmRNAanduPARmRNA，uPAmRNAanduPARmRNA.Conclusion:TheCBmRNA，uPAmRNAanduPARmRNAshowstronglyexpressioninHCCandtheymayinduceeachother,promotecooperativelyinvasionandmetastasisofHCC.

Keywords:hepatocellularcarcinoma；cathepsinB；uPA;uPAR；neoplasminvasiveness；neoplasmmetastasis

基底膜和细胞外基质是肿瘤细胞侵袭的第一道屏障。目前研究发现，组织蛋白酶B(CathepsinB，CB)对基底膜和细胞外基质的降解是恶性肿瘤侵袭转移的关键步骤之一[1,2]，尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体构成的uPA/uPAR系统介导的纤溶酶系统可能在其中发挥核心作用，而它们在肝细胞肝癌演进过程中的变化特点、相互关系鲜见报道。本研究应用逆转录聚合酶链式反应方法检测肝细胞肝癌组织中CB、uPA和uPAR基因表达，分析其间的相关性，探讨它们在HCC侵袭转移中的作用和机制。

1材料和方法

试剂与仪器CB、uPA、uPAR、β-action基因引物序列采用PrimerPremier自行设计，由北京赛百盛基因技术有限公司代为合成，并用高效液相色谱法确认合成产物的纯度。Trizol总RNA提取试剂盒。PE2400PCR扩增仪。

标本采集及分组取自2002-2004年温州医学院第一、第二附属医院手术切除的肝组织。所有标本离体30min内经%DEPC清洗后装入冻存管，置-140oC液氮储存箱保存待用。分为：①对照组12例。②肝细胞肝癌癌旁组织组25例。③HCC组34例。

逆转录聚合酶链式反应检测CB、uPA、uPAR基因取50mg标本组织，制成匀浆，冰浴下加入Trizl提取总RNA；采用M-MuLV按标准程序进行逆转录；续PCR扩增。基因引物序列为：①CBmRNA:正链5′瑼CAGCCCGACCTACAAACAG?′,负链5′瑿CAGTAGGGTGTGCCATTCT?′,产物为239bp。②uPAmRNA：正链5′瑼TCAGCTTCACAACAGTCAT?′，负链5′瑼GAATTCACCACCATCGAGA?′，产物为474bp。③uPARmRNA：正链5′瑿AGACTTGCTGTGTGACCTCA?′，负链5′瑼ATAACAACAACACAACAGCGG?′，产物为184bp。④β-action：正链5′瑿AGCTACAGCTTCACCACCA?′，负链5′璆TCACCTTCACCGTTCCAGT?′，产物为696bp。电泳结束后取出凝胶，用ImagemasterVDS成像系统摄影，图像分析软件(TotallabV101)行灰度扫描分析。以目的基因与β-actin的PCR产物条带灰度值之比作为其mRNA水平的相对量。RT-PCR反应体系中未加入逆转录酶的作为空白对照。

统计学处理方法采用软件完成。多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析，方差齐性者用LSD法，方差不齐者行Games-Howell法。

2结果

三组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的表达情况RT-PCR实验显示，HCC组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的产物条带亮度明显高于PPT组和C组，PPT组与C组的条带亮度差异不大；HCC组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的条带光密度比值均高于C组和PTT组，差异有显着性。PTT组与C组比较三指标差异均无显着性，见表1。

CBmRNA，uPAmRNA和uPARmRNA表达的相关性分析将全部71例肝组织RT-PCR实验的CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA表达做相关分析表明，CBmRNA与uPAmRNA，CBmRNA与uPARmRNA，uPAmRNA与uPARmRNA之间均存在显着的正相关关系。

3讨论

CB属半胱氨酸蛋白水解酶，能在酸性环境中分解蛋白质，刺激肿瘤细胞生长，参与肿瘤血管生成，溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织[1，2]，还可激活uPA。uPA是一种由内质网膜系统合成的丝氨酸蛋白水解酶。uPAR是uPA的特异性受体，广泛存在于体内多种血细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞上。uPA只有和uPAR同时表达时，才能发挥作用。uPAR可在细胞表面浓集uPA，而uPA又可上调uPAR的表达。在uPAR的参与下，uPA对纤溶酶原的激活为正反馈逐级放大效应。CB、uPA及其激活的其他蛋白水解酶促进细胞外基质和血管基膜的降解。uPAR与玻黏蛋白及整合素相互作用，增强细胞黏附，参与uPA信号传导和细胞趋化，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成[7,8]。

本研究结果显示，肝癌组织中CB、uPA和uPAR基因皆呈现高表达，表明恶性肿瘤的侵袭转移是一个多种细胞外基质降解酶参与的复杂变化。相关性分析显示，随着CBmRNA表达的增强，uPAmRNA和uPARmRNA的表达也相应地增强，其间存在高度的正相关关系，表明它们对细胞外基质的酶解是相互联系、协同促进的，其可能是由于CB高表达诱导、激活uPA，uPA又上调uPAR的表达，进而促进uPA介导的纤溶酶系统降解细胞外基质和基底膜的连续过程而导致侵袭与转移。Sameni等[9,10]采用免疫荧光法对人类神经胶质瘤和乳腺癌细胞表面CB对IV胶原降解图像的分析也表明，CB既可以直接降解肿瘤细胞外基质，又可以通过激活蛋白水解级联的下游蛋白酶uPA，间接促进肿瘤细胞外基质降解。有实验显示，细胞表面存在膜联蛋白II异四倍体结构，它是一种细胞表面结合蛋白，既能与CB前体结合，又能与单链和双链的成熟CB结合，在多种恶性肿瘤组织中表达上调，尤其是转移性癌细胞的表面；肿瘤细胞表面的AIIt可能提供一种对接平台或媒介，把CB和uPA等以及能被它们水解的底物连接到几近闭合的细胞表面，促进细胞外基质蛋白的降解，导致恶性肿瘤的侵袭转移[11]。

【参考文献】

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