二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类课件

基

因

工

程四川大学李永红5

2

3

4

1

6

7

89基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程基因工程3基因工程的基本条件C用于基因转移的受体菌或细胞B用于基因克隆的载体A用于核酸操作的工具酶A用于核酸操作的工具酶Enzymes限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA修饰酶核酸外切酶单链DNA内切酶一、限制性核酸内切酶第一节

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）2.性质内切酶。原核生物。即在核酸分子链的内部制造切口的酶。自我保护作用。3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基I型限制性内切酶

目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶

III类限制性内切酶

首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌

B株和

K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：

TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶

如

EcoB和

EcoK。未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。

（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与DNA的来源无关。2.II类限制性内切酶

分离的第一个酶是HindⅡEcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’

3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处。（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：①

5’端凸出（如EcoRI切点）GAATTC

CTTAA

G

GAATTC

CTTAAG5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

②

3’端凸出（如PstI切点）GACGTC

5’--3’

3’--5’

5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

①连接便利

（4）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

识别位点相同，但切点不同。如XmaI和

SmaI。②不完全同裂酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、Xho

Ⅱ等（6）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBgl

Ⅱ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBgl

ⅡSau3A限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

（7）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。

①星号（*）活性限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！7在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（8）Ⅱs型限制性内切酶移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNN

HgaICTGCGNNNNNNNNNN

5’

3’

3.III类限制性内切酶

在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、

Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、

Mg2+和SAMMg2+

ATP、

Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：

TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：

三、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus

influenzae）用Hin表示。4.

限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。2.

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3.

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR

I，EcoR

V。DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度

四、影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长保温时间④

扩大反应体积（

>20l）一般采取大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA的甲基化程度

dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度

是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液(Buffer)（1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：

维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。五、限制性内切酶对DNA的消化1.内切酶与识别序列的结合模式

1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2.完全消化

12341234只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。3.局部消化

123414?大多数酶可用65oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。4.限制酶酶切反应的终止

5.几种常用限制酶识别位点6.限制性内切酶识别序列的交叉列表

AATTACGTAGCTATATCATGCCGG********MaeII

HpaⅡc

MspIc

****AluI****

A****TNla

Ⅲ

A****TApoI

HindⅢ

AflIII

AgeI

BsrFI

A****TA****TSspI

A****TAATTACGTAGCTATATCATGCCGGA****TNsp7524C****GNcoI

StyI

DsaI

XmaI

AvaI

C****GNdeI

C****GPmlIBsaAI

PvuII

NspBII

SmaI

C****GC****GG****CEcoRI

ApoI

NgoMI

BsrFI

AATTACGTAGCTATATCATGCCGGG****CBseHI

G****CEcl136IIEcoRV

NaeI

G****CG****CAatII

SacI

BanII

HgiAI

Bsp1286

SphI

Nsp7524T****ABspHI

BspMII

T****AT****ASnaBI

BsaAI

T****AT****ACGCGCTAGGATCGCGCGGCC****MboIc

Sau3AIc

****BfaI

HinpI

****BstUI

DpnI

HaeIII

****

HhaIA****TA****TMluI

AflIIISpeI

BglIIBstYI

A****TA****TEco47IIIStuI

A****T

CGCGCTAGGATCGCGCGGCCA****THaeIIC****GDsaI

AvrII

StyI

EagI

EaeI

GdiII

C****GC****GNspBII

C****GSacII

PvuI

C****GBsiEI

BsiEI

G****CBssHII

NheI

BamHI

BstYI

KasI

BanI

Bsp120ICGCGCTAGGATCGCGCGGCCG****CNarI

BsaHI

G****CG****CG****CT****ABbeI

HaeII

ApaI

BanII

Bsp1286

T****AXbaI

BclIEaeI

T****ANruI

FspI

MscI

T****AT****AGTACTATATCGATGCATTAA********Csp61TaqI

MseI

****RsaI

****

A****TA****TA****TClaI

AseI

A****TScaI

A****TGTACTATATCGATGCATTAAA****TNsiIC****GBsiWISfcI

XhoI

AvaI

AvaI

SfcI

C****GC****GC****GC****GPstI

G****CAsp718BanISalIApaLI

GTACTATATCGATGCATTAAG****CAccI

AccI

G****CBsrl107IHincII

HpaI

HincII

G****CG****CKpnI

Bsp1286HgiAI

T****AT****ABstBIT****ADraI

T****AT****A从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节

DNA连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。（1）大肠杆菌连接酶1.两种DNA连接酶只能连接粘性末端。二、DNAligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：

NAD+2.连接条件1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度1.最佳温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。2.实用温度所以一般采用

4~16C。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例

2.反应温度12.5℃。五、影响连接反应的因素10~20倍。一般14~16℃第三节

DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶的特性比较三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大肠杆菌DNA聚合酶

I主要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质①一条单链多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。

③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成为Klenowfragment。①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②

Mg2+③

带有3’—OH游离端的引物④

DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反应条件-OH5’

3’

dNTPs标记①

核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交标记已知序列的核酸片断②探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5’

3’

③

DNA聚合酶I对探针序列的标记切口转移法(nicktranslation)：放射性同位素标记：DNA聚合酶I同时具备5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

纯化的DNA片断DNaseI制造单链切口DNAPolI进行切口转移一种-32P-dNTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记82.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolI

Klenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶①

3’端补平5’

5’

klenow②

DNA3’末端标记补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种

-32P-dNTPs末端标记的DNA

限制性内切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h③

cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’

3’

3’

5’

5’

3’

引物（1）

T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’

5’

（2）

T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②

DNA3’末端标记酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

内切酶切无dNTPsa.放射性标记的优缺点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。b.非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。纯化的DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接臂光敏基因+光照抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的识别——亲和素：是一种鸡卵清蛋白。细菌中avidin的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒(kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。酶的作用：化学发光底物HRPO和AP的显色反应底物发光反应机理iv）用非放射性标记的探针检测原理生物素探针序列待测基因亲和素酶底物中间产物产物发光探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：①T7基因5编码的大亚基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。（2）T7DNA聚合酶的特点①持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。②

3’5’外切酶活性高单链和双链都能降解。③不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍②进行末端标记①

以大分子量DNA为模板的合成如M13③补平隐蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法标记3’末端。与T4DNA聚合酶相同。合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端。5.修饰后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7DNA聚合酶的用途①

DNA测序双脱氧法。②

标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端6.逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosis

virus,AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。①链有反转录活性和

RNaseH活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA（3）逆转录酶的用途②链RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。①

合成cDNA以oligo

dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5’

3’

mRNA5’

cDNA②

合成DNA探针用随机引物（randomprimer）或oligo

dT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）③

RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。第四节

DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1.来源小牛胸腺。2.组成大小两个亚基。3.特性5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）②不需要模板！①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。③底物可以是单链DNA、

是3’—OH突出的双链DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④

随机添加的dNTPs。

如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA5’

3’

TTTdTTP

，末端转移酶4.末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5’

3’

5’

3’

CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA5’

5’

HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow补平AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA（3）非放射性标记DNA片断的3’端AAGCTTTTTTCGA

AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位点HindⅢ位点连接催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。（生物素-11-dUTP等）二、T4多核苷酸激酶1.来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP多核苷酸激酶3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

碱性磷酸酶（1）正向反应（forwardreaction）（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。

三、碱性磷酸酶1.碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。2.碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体分子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’

5’

5’

A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。ATTCGA

AGCTTAAGCTTA

ATTCGA

连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’

P-AGCTTA-OH5’

3’

HO-ATTCGA-P5’

外源DNA9第五节

核酸外切酶（

Exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、单链DNA外切酶1.大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切识别5’-OH2.大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exo

Ⅶ）5’3’、3’5’外切识别3’-OH、5’-P二、双链DNA外切酶1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’5’外切识别3’-OH主要用途：在DNA双链的末端产生出单链区域。5’

5’

5’

5’

exo

Ⅲ与klenow配合进行3’端标记-OHHO-2.核酸外切酶（

exo）5’3’外切。主要用途：使DNA双链变成单链（短）。5’P--P5’

5’

5’

exo

成为测序模板。识别5’-P（但不能降解5’-OH）3.T7基因6核酸外切酶5’3’外切。用途与

exo一样。既