第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养课件

第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第一节谷氨酸生产菌的主要特征

一、现有谷氨酸生产菌的分类

现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.棒状杆菌属(Corynebacterium)

2.短杆菌属(Brevibacterium)

3.小杆菌属(Microbacterium)

4.节杆菌属(Arthrobacterium)二、现有谷氨酸生产菌的主要特征细胞形态短杆形、棒形；革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢，不能运动；需氧型微生物；生物素缺陷型；脲酶强阳性；不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变；二氧化碳固定反应酶系强；异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱；α-酮戊二酸氧化能力微弱；柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强；具有向环境泄露谷氨酸的能力；不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上；第二节国内谷氨酸生产菌国内谷氨酸生产菌（1）北京棒杆菌（As1.299）突变株：7338、D110、WTH-1（2）天津短杆菌（T613）突变株：TG-961、FM-415、S9114、CMTC6282（3）鈍齿棒杆菌（As1.542）突变株：B9、F-263第三节谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化一、种子的菌体形态斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及"V"字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.7～0.9*1.0～3.4μm。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。第四节谷氨酸发酵的代谢控制育种（1）日常菌种工作定期分纯小剂量诱变刺激高产菌保藏（2）选育耐高渗透压菌种耐高糖（20-30%）耐高谷氨酸（15-20%）耐高糖、高谷氨酸（20%+15%）（3）选育不分解利用谷氨酸菌株

以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或微弱（4）选育细胞膜渗透性好的菌株抗VP类衍生物：香豆素、芦丁选育溶菌酶敏感性突变株选育二氨基庚二酸缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型温度敏感型（5）选育强化CO2固定反应的菌株以琥珀酸为唯一碳源生长快的菌株。丙酮酸缺陷型（6）选育减弱乙醛酸循环的突变株选育琥珀酸敏感型、不利用乙酸突变株。（7）强化柠檬酸到α-酮戊二酸代谢菌株选育柠檬酸合成酶活力强的突变株选育抗氟化钠、氟乙酸菌株（8）解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株抗谷氨酸结构类似物耐高谷氨酸谷氨酰胺抗性菌株酮基丙二酸抗性菌株（9）强化能量代谢突变株选育呼吸抑制剂抗性菌株，抗丙二酸、氰化钾抗性菌株。选育ADP磷酸化抑制剂抗性菌株，2，4二硝基酚、砷抗性菌株。寡霉素抗性菌株。（10）减弱HMP途径后段酶活性的突变株

选育抗嘌呤、嘧啶类似物的突变株。第五节应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌应用转化法选育谷氨酸生产菌应用转导法选育谷氨酸生产菌应用重组DNA技术构建谷氨酸工程菌原生质体融合新技术一、菌种扩大培养的任务为发酵罐的投料提供纯而壮、相当数量的代谢旺盛的种子。氨基酸生产菌一般用二级培养第六节菌种的扩大培养和种子的质量要求二、菌种的扩大培养过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐（1）斜面菌种的培养

葡萄糖0.1%，蛋白陈1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。一般只移接三代典型的分批发酵工艺流程图成品（2）一级种子培养a.培养基组成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5~3.5%(按质增减)，pH7.0。b.培养条件500mL→1000mL→1000L置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34℃。一级种子质量要求种龄：12h，pH值：6.4±0.1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5％以下无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)(双层平板法、划线法、液体培养法）镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。（3）二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。培养基组成水解糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5~3.5%(按质增减)，消泡剂0.5-1kgpH7.0。种子罐的灭菌空消0.15-0.2MPa，40-60min实消118℃，5min培养条件接种量：0.8~1.0％培养温度：32~34℃培养时间：7~8h通风量：通风比：单位体积发酵液单位时间通过的空气量(v/v.min)50L种子罐1:0.5、搅拌转速340r／min；250L种子罐1:0.3、搅拌转速300r／min500L种子罐1:0.25、搅拌转速230r／min二级种子的质量要求种龄：7~8hpH：7.2左右

OD值净增0.5左右无菌检查(-)

噬菌体检查(-)革兰氏染色：阳性反应三、影响种子质量的主要因素培养基氮源丰富、生物素充足、碳源较少。温度避免温度过高和波动较大pH0时不宜过高，培养结束不易过低溶解氧溶氧水平不易过高。接种量

1%-2%培养时间

7-8小时第七节、菌种保藏技术保藏原理：挑选优良品种，抑制微生物的代谢活性，创造休眠环境。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便。保藏后使用前需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。保藏方法(1)低温冷冻保藏；(2)转接培养或斜面传代保藏；(3)矿物油保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。(1)低温冷冻保藏-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止分类：普通冷冻保藏(-20℃)超低温冷冻保藏(-60一-80℃)冻干保藏液氮冷冻保藏特点：简单有效培养物运输较困难超低温冷冻保藏(-60一-80℃)超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。冻干保藏

是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。特点：冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力。冻干后的菌株可常温保存，便于运输。必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等。液氮冷冻保藏此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备（2）传代保藏斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用。（3）矿物油保藏将琼脂斜面培养物直立浸入矿物油中于4~6℃下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌。保存时间1~2年。（4）载体保藏麦壳，砂土灭菌后可用作载体,培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。多用于产抗生素菌种。保藏时间2~10年。菌种衰退衰退：菌种在培养或保藏过程中，由