水杨酸甲酯对烟草幼苗耐低温胁迫能力的影响

水杨酸甲酯对烟草幼苗耐低温胁迫能力的影响摘要：烟草（Nicotianatabacum），亚热带喜温作物，当苗期温度低于12°C是，会对烟草幼苗的生长发育产生严重的影响，造成烟草幼苗生长发育缓慢、根系发育不良、早花等现象，严重时可造成巨大的经济损失。本文通过研究对烟草幼苗喷施水杨酸甲酯后，烟草幼苗在低温条件下的生长发育状况，得到抵御低温胁迫的最佳喷施浓度，减少低温对烟草幼苗所带来的影响。关键词：烟草幼苗；低温胁迫；生长生理；外源物质1前言：低温对烟草幼苗的影响苗床期，当温度低于12C，会产生低温光抑制，烟苗的叶片发育受到影响，光能利用率和光吸收降低，即使是恢复到适宜的生长条件后，光和生产力仍表现出持续性的降低，光合作用严重下降。同时光抑制还会抑制碳同化，减弱光合链上类囊体膜上的光合电子传递过程。同时由于低温的原因，还会导致烟草种子发芽迟滞，出苗时间推迟，发芽率下降以及苗期烟苗生长发育迟缓的问题。当低温环境持续一段时间甚至会引起烟苗早花等问题【1】。而山东地区早春时间普遍存在“倒春寒”现象，导致烟草育苗期间出现低温损害，影响烟叶的生长发育和产量品质的形成。外源化学物质诱导提高植物抗冷性的研究现状利用植物激素类物质诱导提高植物抗冷性植物激素是指在植物体内合成的、能够调节植物个体生长发育的微量有机物。逆境能使植物激素的活性和含量发生变化，并通过这些变化来影响生理过程。利用外源化学物质诱导处理，可提高植物的抗冷性【2】。水杨酸（salicylicacid；SA）是普遍存在于植物中的酚类化合物，作为植物内源生长调节物质参与植物开花、种子萌发、离子吸收等许多生理生化过程，并作为植物信号分子参与植物的逆境胁迫生理反应。刘国强等研究表明低温胁迫下外源SA能增强枇杷幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，提高还原型谷胱甘肽和类胡萝卜素的含量，减少丙二醛的积累，抑制叶绿素的降解【3】。张素勤研究发现，经SA处理后，茄子超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性均提高，膜脂过氧化物丙二醛（MDA）含量降低，茄子抗寒性的到提高【4】。姜勇等对打破紫茎泽兰种子休眠及幼苗状态时发现，利用水杨酸处理对种子的幼苗鲜重具有显著影响。其中全光条件下，0.05mol/L处理效果最明显，较对照提高39％【5】。外源化学物质处理提高烤烟抗冷性的研究进展前人关于应用外源化学物质对烤烟影响的研究主要集中在生长发育和烤后烟叶产量、产质方面，对诱导提高烤烟的耐旱性和耐盐性的研究也比较多，但是对于诱导提高抗冷性的研究报道相对来说很少。张燕等用聚乙二醇（PEG）溶液处理烟草种子，研究在5°C低温胁迫下PEG对其烟苗生理生化特性的影响【6】。结果表明，PEG浸种处理能够提高低温胁迫条件下烟苗的存活率，烟苗中可溶性糖和脯氨酸含量、叶绿素含量、呼吸速率和核酸等含量均明显高于未用PEG浸种的烟苗。同时该人还发现用CaCl2溶液浸种能够提高烟草幼苗膜保护酶活性，SOD、CAT和POD等保护酶活性下降程度较轻，降低膜透性、丙二醇含量和细胞相对电导率。恢复生长后，幼苗膜透性和保护酶活性恢复较快【7】。1.3水杨酸甲酯对烟草幼苗耐低温胁迫能力的生理效应的研究意义烟草是我国的重要经济作物，在我国国民经济发展中占有十分重要的位置。在我国北方烟草种植区常会受到“倒春寒”带来的低温侵害，产生早生快发难、引起早花等问题，对烟草的生长发育和产量品质都有明显的影响。因此，研究烟草抗寒性生理指标及机理对烟草的种植生产具有重要意义。目前烟草生产中应用的外源化学物质较多，但专门应用于烟草抗寒性方面的外源化学试剂较少，因此本人通过前人的研究筛选出适宜进行外源化学诱导的药剂及其浓度，利用不同浓度诱导烤烟幼苗，并对烤烟幼苗进行低温胁迫，通过测得的相关光合指标和生理指标，分析外源化学物质对烤烟幼苗抗寒性的影响，探明外源化学物质诱导增强烤烟幼苗抗寒性的生理基础和作用机理，为外源化学物质在抗寒诱导中的应用提供基础理论依据，并为生产上提高烟叶产量品质提供参考【8】。材料与方法供试材料供试烤烟品种烤烟品种为中烟100和云烟872.1.2供试外源化学物质水杨酸甲酯2.2实验设计与方法选取两烤烟品种包衣种子分3批次于漂浮盘中播种育苗，待长至3叶时移于装有营养土的直径10cm的营养钵内，每钵定植两株，在25°C下培养。当烟苗长至6-7叶时，每个品种各取生长一致的烤烟幼苗24株，外部喷施水杨酸甲酯诱导处理烤烟幼苗，设0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L四个浓度梯度，对幼苗定量喷洒20ml，对照喷施等量去离子水。常温放置24h后，对照在CK1在25C下继续培养。对照CK2与喷施化学药剂的幼苗移入光照培养箱中进行低温胁迫处理，温度设定为8°C,光照时间12h，光照强度为2500lx。72h后恢复常温并标定幼苗自下而上第四、五、六片叶为试验材料，用于指标测定。3次重复，每个处理共测6株。2.3相关指标测定光合指标的测定选择生长一致的叶片在上午10：00用Li-6400便携式光合测定仪测定叶片的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度等指标叶绿素相对含量的测定利用SPAD-502叶绿素仪分别测定各处理组幼苗的相对叶绿素含量指数，在测定当日10：00与光合指标测定同时进行。测定叶片与光合指标测定叶数相同，在每个叶片上取2个点测定SPAD值，每株测定3片叶片，取平均数作为该植株的SPAD值。2.3.3过氧化物酶(POD)活性的测定参照肖浪涛愈创木酚法测定。取1.0g样品，加适量0.05mol/L磷酸缓冲液(pH5.5)研磨成匀浆，以3000r/min离心10min，上清液转入25ml容量瓶中，沉淀用磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶，定容至刻度，低温保存。在反应体系中，依次加入2.9ml0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml2%过氧化氢、1.0ml0.05mol/L愈创木酚和0.1ml酶液，并立即于34°C水浴中保温3min，然后迅速稀释2倍，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟内A470变化为0.01位1个酶活力单位（U）【9】。过氧化物酶活性【卩/（g・min）】=（△A470xV）/（WxVtx0.01xt）式中△A470：反应时间内吸光度的变化值V：酶提取液的总体积（ml）W：提取液的植物样品的鲜重（g）Vt：测定时加入酶液的体积（ml）t：反应时间（min）2.3.4过氧化氢酶（CAT）活性的测定过氧化氢酶活性的测定参照邹琦的紫外分光光度法【10】。取烤烟幼苗0.5g叶片于预冷的研钵，加入0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液5ml,在预冷的研钵内研磨成匀浆，1500r/min冰冻离心，上清液为CAT酶粗提液。反应体系依次加入1.5ml0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液、0.3ml1mmol/L过氧化氧、0.2ml酶液、1ml蒸馏水。于紫外分光光度计240nm波长下测定吸光度，连续记录4min内的吸光度值，以每分钟内A240变化0.01为1个酶活单位，通过公式计算CAT酶活性。过氧化氢酶活性=（△A240xV）/（WxVtx0.01xt）式中V：酶提取液的总体积（ml）W：提取酶液的植物样品的鲜重（g）Vt：测定时加入的酶液的体积（ml）2.3.5丙二醇（MDA）含量的测定参照肖浪涛的硫代巴比妥酸（TBA）法测定。取1.0g样品，加入2ml10%TCA,研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，所得匀装在3000r/min离心10min。取上清液4ml（对照为4ml蒸馏水），加入0.6%TBA（用10%三氯乙酸配制）溶液4ml，沸水浴反应15min后迅速于冰水中冷却后以3000r/min下离心10min。取上清液测定450nm、532nm、600nm波长下的吸光值【9】。MDA浓度（C）=6.45（A532-A600）-0.56A450MDA含量（|imol/g）=CV/W式中C：由标准曲线上查得的MDA浓度（ymol/L）V：提取液体积（ml）W：样品质量（g）2.4数据统计分析用Excel进行数据处理，采用DPS3.0进行方差分析结果与分析低温胁迫对烤烟幼苗生理生态指标的影响低温胁迫对考研幼苗光合指标及叶绿素相对含量的影响从表1可以看出，中烟100和云烟87两个烤烟品种低温对照（CK2）幼苗的净光合速率（Pn）、胞间浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）及叶绿素相对含量均显著低于常温对照（CK1）。特别是气孔导度（Gs）下降幅度最大,与常温对照（CK1）相比，中烟100和云烟87的低温对照（CK2）分别下降了75.3%和84.8%；其次下降幅度较大的是净光合速率（Pn），两品种的CK2分别比CK1低76.2%和84.5%；与其他光合指标相比，胞间CO2浓度（Ci）下降幅度较小,两品种的CK2分别比CK1减少了48.3%和44.5%。这也表明在低温胁迫下气孔导度（Gs）最为敏感，使气孔关闭，胞间CO2浓度（Ci）降低，引起净光合速率（Pn）的下降，这也证明了烤烟光合作用的主要限制因素是由气孔引起的。两烤烟品种的叶绿素相对含量下降幅度基本持平，表明两烤烟品种在低温胁迫下叶绿体都受到了损害。从两烤烟品种来看，除了云烟87的蒸腾速率下降幅度略低于中烟100外，其余各项指标均高于中烟100，表明云烟87对低温胁迫比中烟100敏感。表1两烤烟品种在低温胁迫下光合指标及叶绿素相对含量的比较3.1.2低温胁迫对烤烟幼苗生理指标的影响由表2得知，烤烟幼苗在低温胁迫下过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性减弱，丙二醇（MDA）的含量显著提高。中烟100和云烟87的低温对照（CK2）体内丙二醛大量积累，两烤烟品种的低温对照（CK2）比常温对照（CK1）分别增加142.98%和169.35%；过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）在低温胁迫下两种酶活性减弱程度基本持平，表明烤烟幼苗在遭遇低温胁迫时CAT和POD的活性都受到了较为严重的影响。从两烤烟品种来看,中烟100的CAT和POD活性减弱程度均低于云烟87,表明中烟100在低温胁迫下酶活性稍高，细胞渗透调节较强，以此来抵御低温对植株的伤害，表明中烟100的耐寒性强于云烟87。表2两烤烟品种在低温胁迫下生理指标的比较3.2预喷施水杨酸甲酯对低温胁迫下烤烟幼苗生理生态指标的影响3.2.1预喷施水杨酸甲酯对低温胁迫下烤烟幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响在本实验中，云烟87和中烟100两个烤烟品种在低温（CK2）下的过氧化氢酶（CAT）活性均低于常温对照（CK1），喷施水杨酸甲酯后CAT活性明显增强。如表3所示：当水杨酸浓度为1.0mol/L时，两烤烟品种CAT活性均达到最大值，特别是该浓度的云烟87品种CAT活性与其余3个水杨酸甲酯处理浓度间存在显著性差异（pV0.05），并与常温对照（CK1）差异不显著；此浓度的中烟100品种CAT活性明显高出常温对照（CK1）12.00%,并达到显著水平（pV0.05），说明此浓度的水杨酸甲酯能显著提高良种品种的CAT活性，避免低温对烤烟幼苗的伤害；当水杨酸甲酯浓度增加到1.5mol/L-2.0mol/L时，CAT活性显著降低,但与低温对照（CK2）存在显著性差异，说明该浓度范围不能有效的增强CAT的活性。表3不同浓度的水杨酸甲酯溶液对烤烟幼苗过氧化氢酶的影响3.2.2预施水杨酸甲酯对低温胁迫下烤烟幼苗过氧化物酶（POD）活性的影响低温胁迫下烤烟幼苗过氧化物酶（POD）活性显著下降，而用水杨酸处理可以显著减缓低温胁迫下烤烟幼苗POD活性的降低。如表4所示：水杨酸甲酯处理浓度范围为0.5mol/L-1.5mol/L时，云烟87和中烟100两品种烟苗POD活性显著高于低温对照（CK2）（pV00.05）；水杨酸甲酯浓度为1.0mol/L时POD活性达到最大值，云烟87和中烟100的POD值分别比常温对照（CK1）高8.62%和1.57%，说明该浓度的水杨酸能显著提高低温胁迫下烤烟幼苗POD的活性；当水杨酸甲酯浓度继续升高到2.0mol/L时，两品种POD活性显著降低,其中中烟100的活性与低温对照（CK2）的POD活性值无显著差异（pV0.05）；表明高浓度的水杨酸甲酯对烤烟POD活性有抑制作用。表4不同浓度的水杨酸甲酯溶液对烤烟幼苗过氧化物酶的影响3.2.3预喷施水杨酸甲酯对低温胁迫下烤烟幼苗丙二醛（MDA）含量的影响从表5看，低温胁迫（CK2）下云烟87和中烟100烤烟幼苗丙二酸含量均显著高于常温对照（CK1），喷施一定浓度的水杨酸甲酯可以减缓低温胁迫对烤烟幼苗丙二酵含量的积累，较低温对照（CK2）有明显减少。就云烟87而言，经水杨酸甲酯喷施处理后烟苗丙二酸含量减少，显著低于低温对照（CK2），但仍高于常温对照（CK1），差异显著（pV0.05），其中浓度为0.5mol/L-1.0mol/L的水杨酸甲酯效果最好。在中烟100中，水杨酸甲酯浓度为1.0mol/L时烤烟幼苗丙二醛含量比常温对照（CK1）低0.86%，且差异显著（pV0.05）；其余浓度处理均仍高于常温对照（CK1）而低于低温对照（CK2）。说明水杨酸甲酯浓度为1.0mol/L时可以抑制低温胁迫下烤烟幼苗丙二醛的含量，减缓低温胁迫的对烤烟幼苗的影响。表5不同浓度水杨酸甲酯溶液对烤烟幼苗丙二醛含量的影响结论1：中烟100、云烟87两个品种的幼苗在两组对照组的生长表现出了明显的差别，苗期长势能够看出明显的差别，低温对照组（CK2）长势明显弱于常温对照组（CK1）。低温对照组（CK2）的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、叶绿体细胞间CO2浓度（Ci）以及叶绿素含量均显著低于常温对照（CK1）；同时低温对照组（CK2）的过氧化氢酶（CAT）及过氧化物酶（POD）活性均显著降低，可溶性糖含量下降，丙二醇的大量积累。2：中烟100、云烟87两个品种的烟草幼苗经过不同浓度（0.5-2.0mol/L）的水杨酸甲酯溶液的处理之后，在低温胁迫环境下的过氧化氢酶（CAT）以及过氧化物酶（POD）的活性显著提高、可溶性糖得到提高，膜脂过氧化产物丙二醇（MDA）含量降低，细胞间CO2含量降低，净光合量提高。其中预施范围为1.0mol/L-1.5mol/L的水杨酸效果最好，特别是当水杨酸甲酯溶液浓度为1.0mol/L时能够显著提高烤烟幼苗的抗寒性，能够很好的抵御低温对烟草幼苗的伤害。3：喷施不同浓度的水杨酸甲酯溶液对烟草幼苗的抗寒性均有不同程度的提高，但是其浓度效应并不是随水杨酸甲酯溶液浓度的提高而无限制的提高，水杨酸甲酯对烟草幼苗的抗寒性的浓度效应存在一个相对适宜的浓度范围，其浓度范围是0mol/L-1.5mol/L,当水杨酸甲酯浓度超多1.5mol/L时，其抗寒性则不会随着浓度的增加而增加。参考文献：崔翠，李君可等，温度胁迫下烤烟幼苗的生理生态响应研究[J].农机化研究，2012，1：185-189.崔翠，李君可等，烤烟幼苗根系在低温胁迫后的形态及生理生态响应[J].农机化研究，2012，4：135-135.代其林•水杨酸对低温下水稻幼苗生理生化特性的影响[D].四川大学，2004.5-6邓世媛，陈建军等，外源水杨酸对低温胁迫下烤烟抗氧化代谢的影响[J].烟草科技，2012，295（2）：71-74.⑸杜永吉，于磊等，低温胁迫下结缕草品种的抗寒性差异[J].中国