选修动物的克隆课件

第三节动物的克隆动物克隆的技术基础：动物的细胞培养和组织培养植物克隆的技术基础：植物组织培养动物细胞的培养和克隆形成1、动物细胞培养（一）动物细胞将动物体内的一部分组织取出分散成单个细胞放在适宜的培养基培养细胞得以生存并保持生命活动现象生存、生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等一、动物细胞的培养和克隆形成机械消化或胰酶消化（1）定义为什么要分散成单个细胞培养？正常细胞癌细胞接触抑制（2）动物细胞培养的条件1）离体2）营养物质：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、

动物血清3）恒温和pH，无需光照4）无菌无毒的环境保证细胞顺利的生长增殖1.培养基营养物质：氨基酸、糖类、维生素、无机盐、激素、其他成分（生长因子【添加动物血清】）培养条件：2.气体：CO2

O2【CO2

培养箱：5%CO2和95%的空气

，培养时培养瓶的盖子处于拧松状态】CO2的作用：调节PH

3.理化条件：PH【5%CO2调节PH

，培养基中加入PH缓冲剂，培养过程中细胞代谢产生很多酸性物质，PH发生改变，为了实时监控培养基中PH的变化，一般在培养基中加入酚红指示剂，若培养基颜色变化超过一定程度，即使细胞密度不大，也要更换培养基。】、渗透压、温度、湿度【CO2

培养箱：37℃，湿度很高】4.无菌条件5.大部分细胞是贴壁细胞，需要一个可贴附的表面【细胞培养瓶或卡氏瓶的壁，培养皿的壁】，会接触抑制，培养密度不能过大。少部分细胞是悬浮细胞，悬浮培养，悬浮细胞的密度可远远大于贴壁细胞，因此利用动物细胞进行工业大规模生产一些药物时，最好使用悬浮细胞。（3）动物细胞的培养过程

取动物胚胎或幼龄动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强分解组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分（4）动物细胞生长特点：（5）动物细胞培养的结果：

不能最终培养成生物体,而是细胞群。1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞，紧贴培养瓶内壁才能生长；2）接触抑制：当培养瓶中贴壁生长细胞彼此紧密接触时，细胞不再分裂；3）细胞只分裂不分化。思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：a、液体培养基b、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体5、培养的细胞为什么会贴壁生长？

大多数组织细胞不适应悬浮生长，他们必须在固体的表面上生长和分裂。

贴壁生长后随细胞数目的增多，会出现接触性抑制的现象。要定期要胰蛋白酶处理使细胞从瓶壁脱离，配成悬浮液，分装多瓶再培养7、若一直在卡氏瓶中持续培养会出现什么情况？分解胶原纤维等蛋白6、用胰蛋白酶处理动物胚胎或幼龄动物的组织、器官？贴壁生长以及接触抑制生长的细胞就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。从机体分离细胞：1.血液中的细胞：容易分离得到【收集血液，离心，弃上清】。血液中的细胞一般是悬浮细胞，不贴壁。2.实体组织中的细胞：机械消化、胰蛋白酶消化【消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分】，制成单细胞悬液，然后贴壁培养。3.直接将组织块放在培养基中培养，细胞从组织块中生长迁移出来，形成生长晕并增大后，就适合进行细胞培养了，这种方法称为外植体培养法。原代培养：除了来源于肿瘤组织外，大部分原代培养物的寿命是有限的，一定时间后会停止分裂、衰老死亡。连续细胞系：能够无限增殖的原因有的是其基因发生了的突变，有的是其基因被人为改造了。目前已经建立了很多连续细胞系，用于科研和药物生产等【用于大规模工业生产的细胞一般是连续细胞系，如单抗生产】。（二）动物组织培养1.概念：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。

动物组织培养过程中可以伴随组织分化。不管采用什么手段和培养条件，组织培养中主要生命活动成分仍然以细胞为单位的。2.结果：由于细胞的运动、变化，使得培养物的组织成分也发生结构和功能变异，结果长期的培养经常只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。3.动物细胞培养和组织培养的联系

两者在一定程度上可看作是同义语，统称为组织培养（组培），即代表各种生物体结构成分的体外培养。

广义的组织培养还包括器官培养，即器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力。动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞，使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一样呈现一定的组织特性。动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最终成为细胞培养。动物器官培养：体外培养动物器官原基、部分或整个器官，使之得以保存、生长。保持器官的结构、功能及分化能力。

组织培养7.1951年，海拉细胞系的建成。6.1950年，人工培养液“199”研制成功1.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。2.1903年，皮肤及白细胞在腹水及血清中存活一个月，且观察到细胞分裂。3.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功看到神经末端的阿米巴运动。4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚心脏组织块进行原代培养和传代培养。5.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞克隆。“组织培养”一词产生真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶；标志着组织培养工作进入全新阶段（三）动物组织培养技术的发展原代培养传代培养从机体取出后立即进行的细胞、组织培养原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长，增殖。…………

二氧化碳培养箱

通过在培养箱内模拟形成一个类似细胞或组织在生物体内的生长环境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、稳定的温度（37°C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。

从动物胚胎或幼龄动物组织切片中取小片样品转入特殊培养液原代培养分装到多个卡氏瓶中传代培养单个细胞悬浮液CO2培养箱中保温培养细胞系机械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）

小结：培养过程

动物组织细胞间隙中含有一定量的胶原纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。原代培养物选择或纯化选择或纯化细胞株细胞株问题：为什么要从原代培养转向传代培养？

原代培养的细胞，到一定时期时，贴壁生长以及接触抑制生长的细胞就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。动物细胞培养中卡氏瓶为什么要放在5%CO2培养箱，明明有盖子？放入二氧化碳培养箱时，瓶口不是完全封死的。（对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在5%左右，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。）细胞系—有关概念:（2）连续细胞系:（1）有限细胞系：连续细胞株有限细胞株细胞株-可连续传代的细胞不能连续培养下去的细胞系能连续培养下去的细胞系大多数具有异倍体核型，有的是恶性细胞系，具有异体致瘤性，有的获得不死性（保留接触抑制，不致癌）例：二倍体细胞通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性。（四）克隆培养法把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术1.定义：未经克隆的异质性细胞系纯系：克隆经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源于一个共同的祖细胞。2.产物:遗传性状均一、表现的性状相似的纯系3.细胞克隆的基本要求:必须保证所建成的克隆来源于单个细胞4.适合于克隆的细胞：

对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞5.提高细胞克隆形成率的措施：选择适宜的培养基添加血清（胎牛血清）

(能促进细胞的生长、增殖和贴附)以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞）激素刺激（胰岛素等）使用CO2培养箱，调节PH

群体细胞>单细胞无限细胞系、转化或肿瘤细胞>原代细胞、有限细胞系6.细胞克隆的主要用途：

从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。

用于研究细胞的遗传规律和生理特性。C（2014浙江高考，3）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是A．连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型B．某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞C．由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆D．未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状B植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白动物的细胞融合技术及其应用动物细胞融合细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核诱导细胞融合物质：诱导剂：灭活的仙台病毒、聚乙二醇

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。思考讨论：1.为什么细胞融合过程需要使用灭活的病毒？2.细胞融合过程中使用的病毒不灭活，行吗？不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合4.细胞融合技术应用于哪些方面？细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。3.细胞融合就是细胞杂交吗？细胞融合是可以要基因型相同或不同的细胞间进行，其中基因型不同的细胞间的融合叫细胞杂交单克隆抗体1.什么是抗体？

效应B细胞2.什么细胞可产生分泌型抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。3.B淋巴细胞与抗体的关系a.B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。b.动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。c.每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？单克隆抗体

由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：化学性质单一、特异性强、灵敏度高

如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何筛选？融合方式？促进融合的技术手段，那种融合方法是动物细胞融合特有的？融合后培养体系中的细胞种类有几种？筛选杂交细胞的方法？①首先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞：筛选的目的：获得杂交瘤细胞。筛选的方法：用选择性培养基来完成，即HAT培养基。选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（TK－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT－）缺陷。筛选的方法：用选择性培养基来完成，即HAT培养基。加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称HAT培养基。其中，氨基喋呤可阻断DNA合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和TK（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成DNA，缺少其中一种，DNA合成不能发生。用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无TK或HGPRT，所以单个或融合骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡。B细胞虽然有HGPRT和TK，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此，只有杂交瘤细胞才能在HAT培养液中生长繁殖。淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡；DNA的主要合成途径被A阻断。骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途经受阻。骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞，可长期生长繁殖。利用淋巴细胞的HGRT将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA。从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。②再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞筛选产生特定抗体的杂交瘤细胞阳性孔方法——抗原-抗体杂交法接下来就要进行第二次“抗体检验”，结果为阳性的细胞就是能分泌目标抗体的单克隆细胞，这些细胞就可以进行大规模的培养。教材中提到可能要进行二次“抗体检验”，是因为进行一次有限稀释法可能得到的不是单克隆细胞，要进行第三次甚至更多次的有限稀释和克隆化培养，还要再进行第三次甚至更多次“专一抗体检验”在克隆培养过程中有可能会出现骨髓瘤细胞的突变无法产生抗体;染色体丢失导致杂交瘤细胞不分泌抗体等;由于不同的杂交瘤细胞的抗体生成率有差异,选择效率更高的杂交瘤细胞等,因此第二次抗体检测可以更好的选择出符合生产要求的杂交瘤细胞。（2019江苏单科，23）如图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT－），在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础B如何得到大量的单克隆抗体？

体内培养体外培养单克隆抗体——化学性质单一、特异性强、灵敏度高单克隆抗体二次筛选并克隆杂交细胞杂交（瘤）细胞体外或体内细胞培养筛选杂交细胞经培养的骨髓瘤细胞诱导细胞融合特异性杂交瘤细胞杂交瘤细胞株提取经过免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术单克隆抗体的制备过程：特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖特点：化学性质单一、特异性强、灵敏度高注射抗原免疫经研究表明，在多种肿瘤细胞中的TOP2A蛋白大量表达，因此成为抗肿瘤的研究靶点，某科研单位制作了TOP2A蛋白的单克隆抗体。请回答：（2）TOP2A蛋白单克隆抗体的制备：将TOP2A蛋白反复多次注射到小鼠体内，使其发生

，取经过免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞在物质

介导下发生细胞融合，形成杂交瘤细胞。并将各杂交瘤细胞单独分装培养，经筛选、

后，获得能产生单一抗体的

（A.连续细胞系B.有限细胞系C.连续细胞株D.有限细胞株）。免疫反应聚乙二醇克隆培养C请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。（1）杂交瘤技术制备单克隆抗体时，利用一定的物质，如生物诱导剂_____________________作介导，使经免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出融合的细胞再进行细胞的_____________培养，获得纯系细胞，同时还要进行______________检验，以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。（2）获得杂交瘤细胞后，在体外培养时需要特别加入的天然成分是___________。（3）有关杂交瘤细胞体外培养的叙述，正确的是_________A.用固体培养基培养B.用滋养层细胞支持生长C.能进行传代培养D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物灭活的（仙台）病毒克隆抗体动物血清C（二）（1）免疫小鼠的脾脏（2）细胞融合基因型不同（3）多次（两次）抗体检验组织培养（4）必须保证分离出来的细胞是一个（合理即可）单克隆抗体的制备1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？2、从何处获得较多的B淋巴细胞？3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？4、怎样筛选出杂交瘤细胞？5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？反复注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾脏PEG、灭活的病毒、电融合等利用HAT选择培养基培养，筛选否用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应8、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理利用效应B细胞产生特异性抗体的功能。利用骨髓瘤细胞无限增殖的特性。利用动物细胞融合将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。利用动物细胞培养大量培养杂交瘤细胞9、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体7、怎样获得大量的单一抗体？体内或体外大量培养特异的杂交瘤细胞，从中提取单一抗体。单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体化学性质单一，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断（利用抗原抗体反应）2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤结合同位素的单抗-----生物导弹单抗放射性同位素植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体化学性质单一、特异性强、灵敏度高的优势动物的克隆繁殖一、动物细胞全能性的表现程度桑椹胚八分裂球受精卵二分裂球四分裂球囊胚原肠胚幼体组织、器官1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。P422、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。受精卵>胚胎干细胞>多能干细胞>单能干细胞>体细胞2.低等动物细胞：全能性一般容易体现。1.高等动物细胞3.癌细胞：仍能逆转为正常细胞。

无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留。一、动物细胞全能性的表现程度为什么动物细胞很难表现出全能性？二、动物难以克隆的根本原因

基因的选择性表达（差异表达），使得细胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化。分化的细胞，其基因组中的基因不同时进行活动。动物基因组一类基因：维持生存，各种细胞中都处于活动状态一类基因：随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。三、核移植和动物的克隆繁殖去核注核重组细胞1.核移植：

利用一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。

胚胎细胞克隆：使用的供体核来自胚胎

体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞1952年，罗伯特.布里格斯：

豹蛙→囊胚细胞核+去核的卵母细胞→发育成个体1978年，童第周：

黑斑蛙→成体红细胞核→去核的卵细胞中→发育成蝌蚪2.动物克隆繁殖：胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。克隆羊培育过程黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利体细胞核移植技术实例2体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理：1.核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（通过调节牛血清浓度，使细胞周期同步化）和电脉冲细胞融合技术，有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。2.重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。3.重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核基因表达的调节蛋白。4.开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因。体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？

高