第十六抗生素类药物分析

第十六抗生素类药物分析第1页，课件共105页，创作于2023年2月第一节概述第2页，课件共105页，创作于2023年2月一、抗生素的定义及特点◆低化学纯度－同系物多、异构体多、降解物多◆活性组分的变异性－生产过程中条件的变化◆不稳定性－不稳定性结构

是指“生物在其生命活动中产生的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称”第3页，课件共105页，创作于2023年2月抗生素的分类β－内酰胺类抗生素四环素类抗生素氨基糖苷类抗生素大环内酯类抗生素多烯大环类抗生素－制菌霉素、两性霉素多肽类抗生素－放线菌素、多黏菌素酰胺醇类抗生素－氯霉素抗肿瘤类抗生素其他抗生素二、抗生素类药物的分类按化学结构分第4页，课件共105页，创作于2023年2月三、抗生素类药物的细菌耐药性第5页，课件共105页，创作于2023年2月第6页，课件共105页，创作于2023年2月第7页，课件共105页，创作于2023年2月第8页，课件共105页，创作于2023年2月三、抗生素类药物的细菌耐药性◆1、耐药性的种类固有耐药性：天然耐药性，由细菌染色体基因决定获得性耐药性：◆2、耐药的机制（1）产生灭活酶，使抗菌药失活如β-内酰胺酶（2）抗菌药物作用靶位改变（3）降低细菌外膜通透性（4）影响主动流出系统第9页，课件共105页，创作于2023年2月第10页，课件共105页，创作于2023年2月四、抗生素药物的质量分析鉴别试验㈠1、官能团的显色反应－特殊基团的反应2、光谱法－特征吸收3、色谱法－保留行为4、生物学方法－抗菌能力第11页，课件共105页，创作于2023年2月㈡检查1、影响产品稳定性的检查项目－水份、酸碱度等2、控制有机和无机杂质的检查项目3、与临床安全性密切相关的检查项目－异常毒性、热原等4、其他检查项目－其他共存组分第12页，课件共105页，创作于2023年2月㈢含量或效价测定1、微生物检定法比浊法管碟琼脂扩散法－抑菌圈Potency:是指每ml或每mg中含有某种抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来判断效价的一种方法方法第13页，课件共105页，创作于2023年2月灵敏度高、需用量少适用范围广－纯品、不纯品、已知的和新的可一次测定同类型抗生素的总效价－无需分离纯化与临床的应用要求一致操作繁琐、费时费力误差较大是结构复杂和多组分抗生素效价测定的首先方法优点㈢含量或效价测定1、微生物检定法缺点第14页，课件共105页，创作于2023年2月2、物理化学法

HPLCLC-MSUV

容量法准确可靠、专属性高、操作简单、省时、样品用量少1、对结构已知或提纯的抗生素2、需要标准品对照仪器分析方法㈢含量或效价测定第15页，课件共105页，创作于2023年2月第二节β-内酰胺类抗生素第16页，课件共105页，创作于2023年2月β-内酰胺类抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素类；7-氨基头孢菌烷酸（7-ACA）；头孢菌素类；一、结构及分类氢化噻嗪环氢化噻唑环第17页，课件共105页，创作于2023年2月青霉素（青霉素钾、钠）第18页，课件共105页，创作于2023年2月氨苄西林

（氨苄青霉素）第19页，课件共105页，创作于2023年2月阿莫西林

（羟氨苄青霉素）第20页，课件共105页，创作于2023年2月普鲁卡因青霉素第21页，课件共105页，创作于2023年2月头孢氨苄第22页，课件共105页，创作于2023年2月头孢羟氨苄第23页，课件共105页，创作于2023年2月㈡理化性质1、酸性与溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不稳定性第24页，课件共105页，创作于2023年2月酸性一、结构特点与性质Na与碱金属(Na+、K+)成盐

（一）羧基

易溶于水

第25页，课件共105页，创作于2023年2月与有机碱(普鲁卡因)成盐

难溶于水普鲁卡因青霉素第26页，课件共105页，创作于2023年2月（二）手性C

头孢菌素类

C6C7青霉素类C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡第27页，课件共105页，创作于2023年2月

（三）共轭体系

头孢菌素类母核有共轭体系

青霉素类母核无明显UV

多数有苯环取代基

UV第28页，课件共105页，创作于2023年2月（四）β–内酰胺环的不稳定性

水溶液

不稳定

干燥纯净

稳定

不稳定性因素四元环张力大

酰胺键易水解

含水量纯度

第29页，课件共105页，创作于2023年2月青霉素类

某些氧化剂酸、碱、青霉素酶（某些金属离子）（温度）降解失效（四）β–内酰胺环

第30页，课件共105页，创作于2023年2月与含水量和纯度密切相关青霉素的降解途径第31页，课件共105页，创作于2023年2月青霉素的降解产物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－强酸性环境青霉烯酸－弱酸性环境青霉醛－强酸性-加热青霉胺－强酸性-加热/青霉素酶-重金属降解产物第32页，课件共105页，创作于2023年2月二、鉴别反应（一）显色反应1、异羟肟酸铁反应第33页，课件共105页，创作于2023年2月2.茚三酮反应

α-氨基-氨基茚三酮蓝紫色第34页，课件共105页，创作于2023年2月3.双缩脲反应似肽键（开环分解）-内酰胺类碱性酒石酸铜紫第35页，课件共105页，创作于2023年2月第36页，课件共105页，创作于2023年2月4.与重氮苯磺酸反应橙黄色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羟基头孢哌酮第37页，课件共105页，创作于2023年2月1.K+、Na+的火焰反应（二）各种盐的反应

焰色→鲜黄色

+醋酸氧铀锌→↓黄

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼钠→↓白

K+第38页，课件共105页，创作于2023年2月2.沉淀反应（青霉素盐）遇酸→↓在过量HCl或有机溶剂中溶解白青霉素青霉素钠

青霉素钾

+H+第39页，课件共105页，创作于2023年2月3.重氮化-偶合反应

重氮化-偶合反应芳伯氨基第40页，课件共105页，创作于2023年2月光谱法（三）1、UV法样品、分解产物Cu2+头孢氨苄λmax=262nm青霉素V钠

A280nm/A264nm=1.30～1.50第41页，课件共105页，创作于2023年2月第42页，课件共105页，创作于2023年2月2、IR法3180cm-1N-Hβ–内酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林为例第43页，课件共105页，创作于2023年2月色谱法（四）1、TLC法对照品对照法2、HPLC法第44页，课件共105页，创作于2023年2月三、杂质检查

药物

检查项目

检查方法

头孢他啶聚合物HPLC法

头孢曲松钠

头孢哌酮钠

头孢噻肟钠

头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法

头孢氨苄有关物质反相TLC法

青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法

第45页，课件共105页，创作于2023年2月

1.头孢他啶聚合物的测定分子排阻色谱法

固定相：葡聚糖凝胶G-10

流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液

流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠

对照品溶液：头孢他啶对照品100µg/ml

第46页，课件共105页，创作于2023年2月1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面积的RSD应小于5.0%

2）测定方法

进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。第47页，课件共105页，创作于2023年2月2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

固定相：ODS

流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）

1）头孢呋辛酯Δ2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯Δ2-异构体。

2）系统适用性试验：各异构体之间的R>1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n>1500。第48页，课件共105页，创作于2023年2月

3）异构体：

相对保留时间1--被测物

2--标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。

异构体A异构体B头孢呋辛第49页，课件共105页，创作于2023年2月3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法

固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3）

供试液：本品50mg/ml

对照液（1）：本品0.5mg/ml

对照液（2）：α-苯甘氨酸0.5mg/ml

对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸

0.5mg/ml第50页，课件共105页，创作于2023年2月结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。第51页，课件共105页，创作于2023年2月4.青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液1.80mg/ml，

结果判断：A280不得大于0.10第52页，课件共105页，创作于2023年2月（一）高效液相色谱法原理：利用青霉素类抗生素在一定条件下在反相硅胶上的保留行为的不同而实现高效分离，并与标准品相对照，而对其进行定量的一种方法。优化色谱分析条件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量测定-容量法和仪器分析法第53页，课件共105页，创作于2023年2月实验注意事项（1）色谱峰要达到较好的分离－基线分离(baseseparation)（2）需要标准品对照，用外标法定量（3）可同时测定多个组分的含量（4）需要排除制剂中辅料等杂质对测定的干扰第54页，课件共105页，创作于2023年2月（二）生物样本中β-内酰胺类抗生素的分析血浆尿样唾液胆汁生物样本色谱柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)样品制备：取血浆200μL，加入内标5μL，再加入HCLO4，窝旋提取InternalstandardIS第55页，课件共105页，创作于2023年2月第56页，课件共105页，创作于2023年2月第三节氨基糖苷类抗生素第57页，课件共105页，创作于2023年2月第三节氨基糖苷类抗生素链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素第58页，课件共105页，创作于2023年2月链霉素链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖链霉双糖胺第59页，课件共105页，创作于2023年2月链霉素：链霉胍链霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺第60页，课件共105页，创作于2023年2月巴龙霉素D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖巴龙胺苷元巴龙二糖胺

糖第61页，课件共105页，创作于2023年2月庆大霉素

糖苷元绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺

糖第62页，课件共105页，创作于2023年2月绛红糖胺紫素胺2-脱氧链霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺第63页，课件共105页，创作于2023年2月庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3

庆大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

庆大霉素C1aR、R1、R2=H

庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3第64页，课件共105页，创作于2023年2月一、结构与性质多与硫酸成盐链霉素

3个庆大霉素5个碱性中心碱性（一）水溶性溶解性（二）第65页，课件共105页，创作于2023年2月链霉素

pH5～7.5庆大霉素

pH2～12

稳定稳定性（四）UV（三）第66页，课件共105页，创作于2023年2月坂口反应N-甲基葡萄糖胺反应麦芽酚反应第67页，课件共105页，创作于2023年2月二、

鉴别

茚三酮反应（一）△羟基胺结构第68页，课件共105页，创作于2023年2月

（2）Molisch反应具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素经酸水解后，在盐酸作用下脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，加入α–萘酚（红紫色）或蒽酮（蓝紫色）第69页，课件共105页，创作于2023年2月红紫色第70页，课件共105页，创作于2023年2月

（3）Elson-Morgan反应水解产生的N-甲基-L-葡萄糖胺在碱性溶液中与乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。蓝紫色第71页，课件共105页，创作于2023年2月

（4）麦芽酚反应－链霉素的特征反应链霉素水解得到的链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除链霉胍，生成α-甲基-β-羟基-γ-吡喃酮（麦芽酚），该化合物与Fe3+在弱酸性溶液中形成红紫色配位化合物。第72页，课件共105页，创作于2023年2月紫红麦芽酚第73页，课件共105页，创作于2023年2月（5）坂口反应－链霉胍的特有反应向链霉素的水解产物链霉胍与NaBrO2反应得产物1；8-羟基喹啉也和NaBrO2反应得产物2。产物1和产物2再相互作用生成橙红色化合物。第74页，课件共105页，创作于2023年2月（八）色谱法（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别

点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色

对照液

判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位置应一致。

点样：供试液

对照液①：硫酸链霉素标准品

对照液②：硫酸链霉素标准品+硫酸新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品

第75页，课件共105页，创作于2023年2月判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小应与对照液①相同，

对照液②应显示分离清晰的3个斑点否则试验无效。

（2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别

比较供试液与对照液各组分的保留时间。第76页，课件共105页，创作于2023年2月

特殊杂质的检查（1）链霉素中链霉素B的检查－TLC法硅胶G板（使用前需活化）、展开剂甲苯-冰乙酸-甲醇（50:25:25）、0.2％二羟萘的乙醇－20％硫酸混合液（2）庆大霉素中组分C的检查－衍生化后HPLC色谱柱、流动相、检测波长、衍生化条件的摸索

组分C的毒副作用和耐药性与庆大霉素有差异，导致产品的效价和临床疗效第77页，课件共105页，创作于2023年2月++410.pH吲哚衍生物巯基醋酸邻苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.第78页，课件共105页，创作于2023年2月1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物第79页，课件共105页，创作于2023年2月RP－HPLC方法

2.规定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%计算

3.峰面积归一化法第80页，课件共105页，创作于2023年2月第81页，课件共105页，创作于2023年2月四、

含量测定微生物检定法各国药典主要采用HPLC法常用于体内药分

返回第82页，课件共105页，创作于2023年2月第四部分：四环素类抗生素TrtracyclinesTC第83页，课件共105页，创作于2023年2月

理化特性（1）酸碱两性－C4（二甲氨基）、C10（酚羟基）（2）旋光性－含有手性中心（一般为左旋）（3）紫外吸收特性－具有共轭双键体系（吸收波长为长波方向）（4）与金属离子的配位化合物反应－酚羟基和烯醇基（5）不稳定性－对各种外界条件，包括氧化剂、酸、碱，易形成差向、脱水和异四环素，颜色加深第84页，课件共105页，创作于2023年2月弱酸性环境ETC差向四环素第85页，课件共105页，创作于2023年2月强酸性环境ATC脱水四环素第86页，课件共105页，创作于2023年2月碱性环境EATC异四环素差向脱水四环素第87页，课件共105页，创作于2023年2月二、

鉴别试验

浓H2SO4反应（一）黄色朱红色绿蓝深紫色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素42SOH盐酸美他环素橙红色第88页，课件共105页，创作于2023年2月FeCl3反应（二）褐色橙褐色深褐色红棕色盐酸多西环素盐酸土霉素盐酸金霉素盐酸四环素3FeCl第89页，课件共105页，创作于2023年2月TLC法（三）盐酸土霉素的鉴别

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金属造成的拖尾现象比较保留时间第90页，课件共105页，创作于2023年2月三、

特殊杂质检查

·

4-差向四环素（ETC）

·脱水四环素（ATC）

·差向脱水四环素（EATC）

·盐酸金霉素（CTC）

有关物质（一）HPLC法（2000版）盐酸四环素第91页，课件共105页，创作于2023年2月四环素有关物质TLC图I.供试液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％第92页，课件共105页，创作于2023年2月吸收度（二）nmmax355268l、盐酸四环素第93页，课件共105页，创作于2023年2月杂质吸收度

取供试品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超过0.12。应严格控制温度和时间第94页，课件共105页，创作于2023年2月四、

含量测定HPLC法

盐酸四环素的测定

系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求。

定量方法：外标法以峰面积计。

第95页，课件共105页，创作于2023年2月第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查1.高分子杂质分子量大于药物本身的杂质总称。第96页，课件共105页，创作于2023年2月

蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。

药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。

外源性杂质内源性杂质第97页，课件共105页，创作于2023年2月2、基本特点－对青霉素而言青霉噻唑多肽－外源