实验 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

实验血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及第1页，课件共16页，创作于2023年2月目的要求掌握722型分光光度计的使用了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定掌握血红蛋白标准曲线的绘制

第2页，课件共16页，创作于2023年2月实验原理溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

分光光度计的使用第3页，课件共16页，创作于2023年2月

朗伯比尔定律：A=εlcε：摩尔吸光系数

c：溶液的浓度

l：液层的厚度

A：物质的吸光度

第4页，课件共16页，创作于2023年2月比色皿的使用手持毛玻璃面，不可触碰光滑面使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液润洗1次使用时比色皿光滑面对准光路使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用蒸馏水润洗1-2次）第5页，课件共16页，创作于2023年2月血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定

血红蛋白(Hb)与O2结合生成氧合血红蛋白(HbO2)，与CO结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)。因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定性和定量分析的基础。第6页，课件共16页，创作于2023年2月如HbO2在可见光波长400~600nm范围内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在415、541和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变，在波长419、540和569nm处出现三个特征的吸收峰，其中在500~600nm范围内2个特征的吸收峰如下图。第7页，课件共16页，创作于2023年2月项目吸收峰数吸收光谱（nm）HbO22541577HbCO2540569第8页，课件共16页，创作于2023年2月第9页，课件共16页，创作于2023年2月仪器和试剂

1．仪器：试管；吸量管；量筒；722型分光光度计；CO发生器。

2．试剂：

（1）浓H2SO4；（2）甲酸；（3）蒸馏水；

（4）血红蛋白溶液。（5）NaOH；第10页，课件共16页，创作于2023年2月实验操作

预热仪器

选定波长

调节T=100％

调节“0”点

测定

关机分光光度计的使用第11页，课件共16页，创作于2023年2月用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动，即制得全血。

（1）氧合血红蛋白（HbO2）液：加蒸馏水20ml，取全血0.1ml（3滴）盛于小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。

（2）碳氧血红蛋白（HbCO)液：

取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体（浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。1．样品的制备：第12页，课件共16页，创作于2023年2月2．吸光度测定：

（1）将如上制备的2种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一次读数均应用空白管调节零点和100%）。（2）先从波长500~600nm分别测定HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。第13页，课件共16页，创作于2023年2月3.吸收光谱曲线的绘制以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸收光谱必有一些差异，对722型分光光度计来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允许的。第14页，课件共16页，创作于2023年2月注意事项

分光光度计应放在干燥处，使用温度为5~35℃。远离强电场、磁场

每次做完实验时，应立即洗净比色皿

为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命

当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记

第15页，课件共