基因工程疫苗

第六章基因工程疫苗

第一节疫苗概述一、疫苗的起源与发展疫苗的起源可以追溯到我国古代。早在4世纪初，东晋葛洪所著《肘后方》中，已有关于防治狂犬病的记载：“杀所咬犬，取脑敷之，后不复发”。在宋真宗时代（公元1000年左右）宰相王达之子患了天花，四处请医无效，最后请来了峨眉山的道人，取其患处的结痂，处理后进行自体接种而治愈，这当是最早的自身免疫治疗（self-Vaccine）

。

逐渐发展成了预防天花的人痘接种法，即从感染天花后的恢复期病人或症状比较轻的病人身上，挑取水泡、脓疱和痘痂内容物并保存1个月左右待其干燥，然后将其研磨成粉末，给健康人的鼻腔吸入，以预防天花，取得了很好的保护效果。这是人类史上最早使用疫苗来预防疾病的记录，较英国医生琴纳（Jenner）发明牛痘苗早了几百年。

15世纪中期我国的人痘苗接种法传至中东，后经改革进行皮下接种。1721年英驻土耳其的大使夫人，将此法又传至英与欧洲各国。人痘的发明是中国人民对世界医学的一大贡献。2000年，美国疾病控制与预防中心（CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC）出版了《疫苗可预防疾病的流行病学与预防学》第6版，在这本被誉为疫苗学权威手册首页的“疫苗接种的里程碑”中，第一项即是“12世纪中国开始用人痘接种预防天花”（见表6-1）。这是对中国首先开始使用人痘接种预防天花是最早的免疫接种形式的肯定。

表5-1疫苗发展史上的里程碑事件

时间事件12世纪中国开始用人逗接种预防天花1721年人逗接种传入英国1796年E.Jenner为JamesPhipps接种牛痘，疫苗接种正式开始1870L.Pasteur发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗1884年L.Pasteur发明了第一个病毒减毒活疫苗——狂犬病疫苗1885年L.Pasteu第一次把狂犬病疫苗接种于人体1901年VonBehring发现了白喉抗毒素，获得第一个医学诺贝尔奖1909年Smith发明了灭活白喉毒素的方法1909年Calmette和Guerin发明了第一个用于人的细菌减毒活疫苗BCG1933年GoodPasture发明了鸡胚病毒培养法1949年Enders及其同事从人细胞系中分离出脊髓灰质炎Ⅱ型Lancing株1954年Enders分离出麻疹病毒1955年脊髓灰质炎灭活疫苗获准生产时间事件1961年人二倍体细胞株建立1963年麻疹疫苗获准生产三价脊髓灰质炎疫苗获准生产1966年世界卫生联盟呼吁全球消灭天花1977年索马里发现最后一例本土天花1979年美国报道最后一例野毒传播型脊髓灰质炎1986年第一个重组疫苗——重组乙型肝炎疫苗获准生产1989年推荐使用二剂型麻疹疫苗1990年第一个多糖结合疫苗——B型流感嗜血杆菌疫苗获准生产1991年西半球报道最后一例野毒株脊髓灰质炎病例乙型肝炎免疫纳入全球计划免疫1994年美国消灭脊髓灰质炎得到证实1995年水痘疫苗获准生产1996年用于婴儿的无细胞型百日咳疫苗获准生产1997年推荐进行扫荡式脊髓灰质炎免疫1999年推荐单一使用脊髓灰质炎灭活疫苗2000年用于婴儿的结合肺炎球菌疫苗获准生产引自：CDC：EpidemiologyandPreventionofVaccine-preventableDisease.6Edition，200017965.14英国乡村医生爱德华·琴纳（EdwardJenner）进行了人类历史上的第一次疫苗接种试验。Jenner从一位感染了牛痘的年轻挤奶农妇的手上挑取了痘苗接种到一名8岁男孩的手臂上。经过几个月的严密观察，发现小男孩获得了免疫保护，一直没有感染天花。1798年9月，Jenner发表了接种“牛痘”预防天花的论文，虽然当时全然不知天花是由天花病毒感染所致，但这一划时代的发明，开创了人工自动免疫的先河。随后，种痘技术传遍了欧洲，后又传到北美和亚洲。为纪念Jenner的这一伟大贡献，巴斯德（Pasteur）将疫苗称为Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。由于长期和广泛地使用牛痘苗，全世界从1977年以后再也没有发现过天花病人。世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）于1979年10月26日庄严宣布，天花已在全球绝迹。这是人类历史上第一个使用疫苗消灭的传染病。19世纪70年代，法国科学家路易斯·巴斯德（LouisPasteur）有关减毒鸡霍乱菌的研究，是继琴纳之后的重大进步。他认为使用减毒的病原体来预防其导致的疾病，比使用相关的动物病原体来预防人类疾病理当更加有效。巴斯德建立了现代意义上的预防接种，即通过实验室内研制的疫苗来预防传染病。随后的羊炭疽减毒活疫苗的试验成功，尤其是1885年首次在人体使用减毒狂犬病疫苗的成功，标志人类进入了一个预防接种的科学新纪元。基于安全原因，正式生产的均为狂犬病灭活疫苗，质量上也在不断的改进。Pasteur在疫苗研制领域的先锋作用和卓越贡献引起了第一次疫苗革命。到19世纪末，人类在疫苗学领域里已经取得了辉煌的成就，包括2个人用病毒减毒活疫苗（琴纳的牛痘，巴斯德的狂犬病），3个人用细菌灭活疫苗（美国Salmon和Smith、法国Chamberlai和Roux的伤寒、霍乱和鼠疫），以及疫苗学的一些基础概念，如Metchnikoff的的细胞免疫（1884年），Ehrlich的受体理论（1897年）及毒素-抗毒素作用。进入20世纪前30年，疫苗学在三个方面取得了重大进展：首先，法国科学家Calmette和Guerin在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递230代，获得1株减毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所谓卡介苗（BCG）。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗。第三，WilsonSmith和ThomasFrancis分别在禽胚中研制成功2种灭活甲型流行性感冒（流感）疫苗。二次大战后，疫苗研究进入了突飞猛进的发展阶段。波士顿的Enders及其同事发展了病毒的体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3价灭活脊髓灰质炎（脊灰）疫苗（IPV），后有Sabin的3价减毒脊灰疫苗（OPV），为人类渴望在地球上消灭脊灰提供了有力武器。同一时期还研制了在鸡胚细胞中培养减毒的麻疹疫苗。60年代研制了在鸡胚中减毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在细胞中培养的风疹疫苗。细菌疫苗方面，70年代细菌夹膜多糖的纯化技术促进了多个侵袭性细菌疫苗的研制成功。同一时期的病毒蛋白纯化技术也促进了血源性乙型病毒性肝炎（乙肝）疫苗的研制成功。20世纪80年代，现代分子技术的应用推动了又一代疫苗的研制，引发了疫苗发展史上的第二次革命，其首要成果是基因重组乙肝疫苗，为人类在地球上消除乙肝提供了希望。与此同时，化学、生物化学、遗传学和免疫学的发展在很大程度上为新疫苗的研制和旧疫苗的改进提供了新技术和新方法（表5-2）。表5-2新技术对疫苗研制和开发的作用及影响

学科领域生物技术作用和影响遗传学基因工程和DNA重组（包括基因克隆和表达，DNA测序，DNA合成，核酸内切酶和工具酶，PCR，全基因图谱）抗原鉴定和抗原分离测定抗原的可变性蛋白质抗原的基因工程基因突变和减毒重组微生物作为载体化学多肽合成鉴定抗原表位研制多肽疫苗蛋白质结构计数及估测T和B细胞表位糖结构多糖疫苗基础研究佐剂，多糖和蛋白质偶联疫苗免疫学单克隆抗体抗原鉴定和抗原分离鉴定抗原表位抗同种异型模拟非蛋白质表位免疫调控新型佐剂基础研究细胞和分子免疫机理粘膜免疫至今已有30余种疫苗成功的用于人类疾病的预防（表5-3）。其中一半以上是病毒疫苗。如天花（poxvirus）、小儿麻痹（poliovirus）、麻疹（Measles）等曾严重危害人类生命与健康的疾病的流行得到了有效的控制。其中天花已被根除，创造了使用疫苗在自然界中彻底消灭一种病原微生物的医学奇迹。人类消灭脊髓灰质炎的目标也即将实现。表6-3人用疫苗发展年表应用年份疾病名称疫苗类型1721天花“人痘”活天花病毒1796天花“天然减毒”痘苗病毒1885狂犬病“不同程度”减毒的灭活病毒1936黄热病活减毒病毒1936流感灭活全病毒1943流感灭活完整（whole）病毒1955小儿麻痹灭活病毒1957狂犬病灭活病毒、鸭胚培养1961小儿麻痹活减毒病毒1963麻疹灭活病毒和减毒活病毒1967腮腺炎活减毒病毒1969风疹活减毒病毒表6-3人用疫苗发展年表应用年份疾病名称疫苗类型1972流脑纯化多糖A和C型1974日本脑炎（乙脑）灭活病毒1976狂犬病灭活病毒、人二倍体细胞培养1981乙型肝炎灭活、血源苗1982脑膜炎球菌脑膜炎纯化A、C、Y、W135型多糖1983日本脑炎（乙脑）活减毒病毒1983水痘活减毒病毒1986乙型肝炎基因重组蛋白质疫苗1991甲型肝炎活减毒病毒和灭活病毒1998轮状病毒腹泻活减毒病毒1998回归热纯化蛋白质疫苗我国自1919年开始建立专门的机构（中央防疫处，北京生物制品研究所前身）从事生物制品的研究、生产，这是我国第一所生物制品研究所。建国后，我国政府重新组建和新建了北京、上海、武汉、长春、兰州、成都等六个生物制品研究所。中国现有疫苗产品生产企业约30家，是世界上疫苗产品生产企业最多的国家（表5-4）。中国的疫苗产品年产量已经超过10亿个剂量单位，疫苗的种类和数量也达到世界之最，其中用于预防乙肝、脊髓灰质炎、麻疹、百日咳、白喉、破伤风的儿科常见病的疫苗生产量达到5亿人份，已经全部实现计划免疫接种。中国生产的疫苗产品已经能够满足防病、灭病的需要。表6-4中国主要疫苗种类和生产厂家

种类制品名称用途生产厂家病毒类重组酵母基因工程乙肝疫苗用于预防所有已知亚型的乙肝病毒的感染。北京天坛生物、深圳康泰重组（CHO）乙型肝炎疫苗预防乙型肝炎病毒感染长春所、兰州所、华北制药甲型肝炎纯化灭活疫苗（VAQTA）VAQTA适用于接触前的主动免疫，以预防甲型肝炎病毒引起的肝炎，但不能预防由非甲型肝炎病毒引起的肝炎。首次免疫应在预计接触前至少2周进行。巴斯德-梅里厄-康纳公司、北京科兴甲型肝炎减毒疫苗用于预防甲型肝炎史克必成公司、长春所、长春高新种类制品名称用途生产厂家风疹减毒活疫苗年龄为8个月以上的风疹易感者巴斯德-梅里厄-康纳公司、兰州所、天坛生物、上海所麻疹减毒活疫苗预防麻疹病兰州所、长春所、上海所森林脑炎灭活疫苗用于预防森林脑炎长春所乙型脑炎灭活疫苗本疫苗免疫接种后，刺激机体产生抗乙型脑炎病毒的免疫力，用于预防乙型脑炎。兰州所、长春所、天坛生物、上海所Ⅰ型肾综合征出血热纯化疫苗预防流行性出血热兰州所、上海所Ⅱ型肾综合征出血热纯化疫苗预防Ⅱ型出血热长春所流行性感冒灭活疫苗6岁以上所有希望预防流感的健康人群巴斯德-梅里厄-康纳公司、史克必成公司、兰州所、长春所、长春高新腮腺炎减毒活疫苗8月龄以上的腮腺炎易感者兰州所、上海所种类制品名称用途生产厂家口服脊髓灰质炎减毒活疫苗预防脊髓灰质炎天坛生物口服轮状病毒活疫苗预防小儿秋季腹泻兰州所水痘减毒活疫苗12月龄以上的水痘易感者长春生物制品研究所、史克必成公司、长春所、上海所人用狂犬病纯化疫苗用于预防狂犬病巴斯德-梅里厄-康纳公司、兰州所、长春所、成都所黄热减毒活疫苗预防黄热病天坛生物联合疫苗吸附白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗该联合疫苗适用于儿童预防白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的基础免疫及加强免疫。巴斯德—梅里厄—康纳公司麻疹、流行性腮腺炎和风疹疫苗预防麻疹、流行性腮腺炎、风疹默沙东公司、史克必成公司甲乙肝联合疫苗预防甲肝和乙肝史克必成公司、北京科兴二、疫苗与基因工程疫苗

传统疫苗（TraditionalVaccine）用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂或者用理化方法将病原微生物杀死制备的生物制剂，用于人工自动免疫以保护人或动物产生免疫力，这些制剂被称为疫苗（多用于预防），即疫苗是由病原体制成的。国内常将细菌制作的人工主动免疫生物制品称为菌苗。将病毒（Virus）、立克次氏体（Rickettia）、螺旋体（Spiralcoil）等微生物制成的生物制品称为疫苗。现在国际上一般将细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素统称为疫苗（vaccine）。基因工程疫苗：上述狭义的疫苗被称做传统疫苗（traditionalvaccine），即完整的病原体为主制成的疫苗；而基因工程疫苗则属于新一代疫苗（NewgenerationVaccine）或高技术疫苗范畴（High-techVaccine）。主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，广义的还包括遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等。现代疫苗（Modernvaccine）：是一种利用现代分子生物学技术使用Ag通过诱发机体产生特异性免疫反应以予防和治疗疾病或达到某种特定的医学目的生物制剂。

三、传统疫苗与新型疫苗的区别：传统疫苗①疫苗的研制则主要是通过人体实验从经验与失败中获得。②20世纪以来，随着病原学、流行病学、免疫学，特别是病毒组织培养技术的发展，大量传统疫苗相继问世。③免疫学的进展，使人们可以通过是否产生中和抗体判定疫苗成功与否。几乎所有免疫保护机制明确，可以产生中和抗体，又易于培养的疫苗都已获得成功。甚至一些新出现的疾病，主要具备上述特点，也可以使用传统疫苗技术迅速研制成功（表5-5）。④对于免疫保护机制不明确，有潜在致癌性或免疫病理作用，以及病原不能或难于培养的疫苗，使用传统疫苗技术就很难研制成功。新型疫苗①新型疫苗则是在分子生物、分子免疫学、蛋白化学以及相应的生物高技术基础上发展起来的（Woodrow，1997）。②重组DNA技术包括促进了疫苗生产技术的发展。

③从现代的观点来看，我们可以把疫苗定义为：一种使用抗原通过诱发机体产生特异免疫反应以预防和治疗疾病或达到特定医学目的的生物制剂。④目前新型疫苗的研究主要集中在改进传统疫苗和研制传统技术不能解决的新疫苗两个方面，包括肿瘤疫苗、避孕疫苗及其它非感染性疾病疫苗的研究，其中发展治疗性疫苗已成为新型疫苗研究的重要组成部分。疫苗类型国内外生产状况国内国外1小儿麻痹（OPV）减毒活疫苗（I-III型联合）+-小儿麻痹（IVP）灭活疫苗（I-III型联合）+-2麻疹减毒活疫苗++3卡介苗（BCG）减毒活疫苗++4白喉-百日咳-破伤风（DPT）亚单位疫苗（联合）++亚单位疫苗（基因工程P）-+5

乙型肝炎亚单位疫苗（血源）++亚单位疫苗（基因工程CHO）+（S）+（S2）亚单位疫苗（基因工程酵母）+（引进）+6乙脑减毒活疫苗+-灭活疫苗++7流脑亚单位疫苗（多糖）++8甲肝减毒活疫苗++灭活疫苗-+9流感灭活疫苗++减毒活疫苗（遗传重配）-+10狂犬灭活疫苗++11风疹减毒活疫苗++12腮腺炎减毒活疫苗++麻疹-风疹-腮腺炎（MMR）减毒活疫苗（三种联合）-+13出血热灭活疫苗++14腺病毒（Ad4，Ad7）减毒活疫苗-+15水痘减毒活疫苗-+16黄热病减毒活疫苗++17轮状病毒腹泻减毒活疫苗（人猴遗传重配）-+减毒活疫苗（人羊遗传重配）+-18伤寒灭活疫苗++减毒活疫苗（Ty21a）-+19钩端螺旋体灭活疫苗+-20霍乱亚单位+灭活（CTB+WC）-+亚单位+灭活（基因工程CTB+WC）++减毒活疫苗（基因工程CBV-HgR）-+21鼠疫减毒活疫苗++22斑疹伤寒灭活疫苗++23布氏杆菌减毒活疫苗++24炭疽杆菌减毒活疫苗++25痢疾减毒活疫苗（基因工程FS）+-26链球菌肺炎亚单位疫苗（多糖）-+27噬血杆菌流感亚单位疫苗（多糖）-+28痘苗（天花）减毒活疫苗+*+*注：“+”为已投入生产，“-”为未生产，“*”为已停止生产第二节病毒疫苗的种类一、传统病毒疫苗

又称常规疫苗或第一代疫苗，是长期以来用于传染病预防的主要生物制品。1、灭活疫苗（deadVaccine）

灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。疫苗液中除含有灭活的病毒颗粒外，还含有细胞成分和培养病毒时加入的牛血清等蛋白类物质，多次接种疫苗容易发生过敏反应。优点制造工艺简单免疫原性的稳定性高易于制备多价疫苗缺点：1）需要严格的灭活操作，保证疫苗中不含有灭活不完全的颗粒。2）灭活疫苗所提供的免疫力较短暂，为完成免疫程序，需要进行多次接种，由于机体反复接受疫苗中的异性蛋白质的刺激，而可能出现不良的过敏反应。3）有些灭活疫苗，如早年制备的麻疹灭活疫苗，可使有些受接种者在以后自然接触麻疹病毒时，引起严重的麻疹感染过敏性反应。4）灭活疫苗虽可刺激机体产生IgM和IgG抗体，但有时却得不到满意的保护效果。2、减毒活疫苗（attenuatedvaccine）减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。当前使用的病毒疫苗多数是减毒活疫苗。活疫苗具有可诱发全面的免疫应答反应（体液免疫和细胞免疫）、免疫力持久等优点。常用的减毒方法有以下几种：1）体外减毒即体外连续传代减毒。在异源宿主中连续传代；在单一宿主中反复连续传代。2）冷适应筛选温度可以改变病毒的特性，得到冷适应株。病毒冷适应株常伴有毒力减弱和各种特征性标志。冷适应筛选稳定的减毒突变株是在传统疫苗设计中较早采用的方法，而且也是最为行之有效的思路。减毒活疫苗与灭活疫苗各有优缺点。前者优于后者。减毒活疫苗可使机体产生亚临床感染，特别当以自然途径，如口服或喷鼻免疫时，可产生广谱的免疫应答，即除循环性抗体IgM和IgG外，在病毒侵入的门户如呼吸道和消化道也可诱生局部抗体IgA。

3、亚单位疫苗（subunitvaccine）亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白，因而能消除病毒（或细菌）的许多无关抗原决定簇和粗制或半提纯的病毒（或细菌）制剂诱发的不良反应。表5-6灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗三类疫苗的比较灭活疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗制备方法通过化学或物理方法使病原体失活通过非正常培养选择减毒株或无毒株以化学方法获得病原体的某些具有免疫原性的成分免疫机理病原体失去毒力但保持免疫原性，接种后产生特异抗体或致敏淋巴细胞接种后病原体在体内有一定生长繁殖能力，类似隐性感染，产生细胞、体液和局部免疫接种后能刺激机体产生特异性免疫疫苗稳定性相对稳定相对不稳定稳定毒力回升不可能有可能不可能免疫接种多次免疫接种一般为一次性多次免疫接种安全性较安全对免疫缺陷者有危险安全性好常用疫苗乙脑、脊髓灰质炎灭活疫苗麻疹、脊髓灰质炎减毒活疫苗白喉、破伤风类毒素，A群脑膜炎球菌多糖疫苗二、新一代病毒疫苗新一代病毒疫苗（新型疫苗）主要指利用基因工程技术研制的疫苗。基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基缺失活疫苗，通常也习惯地将遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特型抗体疫苗包括在新型疫苗范畴。

1.NewGenerationvaccineorHigh-techVaccine（高技术疫苗）①基因工程亚单位疫苗（geneengineeringsubunitvaccine)②基因工程载体疫苗(geneengineeringvectorvaccine)③核酸疫苗(nucleicacidvaccine)④基因缺失活疫苗(genedeletedlivevaccine)⑤蛋白工程疫苗(proteinengineeringvaccine)2.遗传重组疫苗(geneticrecombinantvaccine)

3.合成肽疫苗(synthticpeptidevaccine)4.抗独特型Ab疫苗(anti-idiotypeAbvaccine)5.微胶囊可控缓释疫苗(controllablereleasedmicro-capsulevaccine)（一）基因工程疫苗geneengineeringvaccine基因工程疫苗，也称遗传工程疫苗（geneticengineeringvaccine），指使用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。主要包括基因工程亚单位疫苗，基因工程载体疫苗，核酸疫苗，基因缺失活疫苗，及蛋白工程疫苗等五种。

1、基因工程亚单位疫苗(geneengineeringsubunitvaccine)基因工程亚单位疫苗，主要是指将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。优点：①产量高；②纯度高；③安全性高；④用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。缺点：与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差。增强其免疫原性的方法：①调整基因组合使之表达成颗粒性结构②是在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球③加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。

2、基因工程载体疫苗（geneengineeringvectorvaccine）基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。优点：疫苗多为活疫苗，重组体用量少，抗原不需纯化，载体本身可发挥佐剂效应增强免疫效果缺点：曾感染过腺病毒或者接种过痘苗的人，对载体微生物已具有免疫力，使之接种后不易繁殖，因而影响免疫效果。

3、核酸疫苗（nucleicacidvaccine）核酸疫苗或称基因疫苗（genevaccine），指使用能够表达抗原的基因本身，即核酸制成的疫苗。优点：①易于制备；②便于保存；③可多次免疫并且容易制成多联多价疫苗。缺点：①外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变；②能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗体的产生，免疫耐受等。4、基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）基因缺失活疫苗使用分子生物学技术去除与毒力有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。优点：①有突变性状明确、稳定；②不易返祖、毒力恢复；③是研究安全有效的新型疫苗的重要途径。5、蛋白工程疫苗（proteinengineeringvaccine）蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。（二）遗传重组疫苗（geneticrecombinantvaccine）遗传重组疫苗是指使用经遗传重组方法（geneticrecombination）获得的重组微生物制成的疫苗。通常是将对人体无致病性的弱毒株与强毒株（野毒株）混合感染，弱毒株与野毒株间发生基因组片段交换造成重组，然后使用特异方法筛选出对人体不致病的但又含有野毒株强免疫原性基因片段的重组毒株。（三）合成肽疫苗（Syntheticpeptidevaccine）合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。优点：①纯度和安全性高；②副作用小；③可长期在常温下保存；缺点：①其抗原性单一；②免疫原性弱。因此须用几种合成肽抗原联合使用，还须用多种方法提高合成肽的免疫原性。（四）抗独特型抗体疫苗（anti-idiotypevaccine）抗独特型抗体疫苗是指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗体（ab2）做抗原制成的疫苗。目前此疫苗尚处于理论性研究阶段。（五）微胶囊可控缓释疫苗(controllablereleasedmicro-capsulevaccine)微胶囊可控缓释疫苗，指使用微胶囊技术将特定抗原包裹后制成的疫苗。特点①小于10μm的微胶囊在注射部位可被巨噬细胞吞噬并携带至淋巴结附近和免疫系统其他部位，具有更强的免疫效果。②大于30μm的微胶囊，更适于做可控缓释。由于微胶囊的保护作用，母体抗体不能使抗原失活，可用于婴幼儿免疫接种。③微胶囊在肠道内不受酸或酶的影响，可用于口服。

第三节基因工程病毒疫苗的开发现状一、急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十几种疾病-预防性疫苗治疗性疫苗艾滋病+（需要）+乙型肝炎++丙型肝炎++戊型肝炎+-（不需要）EBV肝炎++表4-2需要研制的基因工程病毒疫苗人乳头瘤病毒感染（宫颈癌）++单纯疱疹病毒感染（Ⅰ、Ⅱ型）++巨细胞病毒感染++呼吸道和细胞病毒感染+-轮状病毒感染+-登革热病毒感染+-埃博拉病毒感染+-注：“+”表示需要，“-”表示不需要

二、值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗对那些免疫保护效果差，或副反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗，使用基因工程技术对其改造，或用基因工程疫苗取而代之，将具有极大的市场前景。传统疫苗可能使用的基因工程疫苗类型流感基因缺失活疫苗，遗传重组活疫苗甲型肝炎重组活疫苗，亚单位疫苗（病毒样颗粒）乙型脑炎基因缺失活疫苗水痘重组活疫苗，基因缺失活疫苗麻疹重组活疫苗，基因工程亚单位疫苗黄热重组活疫苗狂犬（人和兽）重组活疫苗，亚单位疫苗（病毒样颗粒）出血热基因缺失活疫苗腺病毒遗传重配活疫苗，重组活疫苗轮状病毒亚单位疫苗（病毒样颗粒）联合疫苗重组多价活疫苗，亚单位联合疫苗表5-3值得使用基因工程技术进行改造的传统病毒疫苗

三、重要病毒性疾病基因工程疫苗研究进展目前，病毒基因工程疫苗主要集中在研制常规技术不能或很难解决的新疫苗和改造免疫保护效果差，负反应较大，或成本较高，或使用不方便的传统疫苗上，有的疫苗兼有预防和治疗两种功能现将我国重要的病毒病基因工程疫苗研究状况概述如下（参见表5-4）。疫苗及靶抗原疫苗类型研究开发现状国内国外1艾滋病毒苗—env.gag.pol.nef.v3亚单位多肽（细胞）亚单位多肽（酵母）亚单位多肽（昆虫）亚单位多肽（痘苗）亚单位多肽（昆虫）亚单位多肽（细胞）载体活疫苗（痘苗）载体活疫苗（ALVAC）研究研究研究研究研究研究研究——Ⅱ期Ⅱ期Ⅱ期Ⅰ期研究研究Ⅰ期Ⅰ期表5-4我国重要病毒病基因工程疫苗研究开发状况完整病毒颗粒减毒活疫苗（SIV）灭活疫苗（SIV）减毒活疫苗（HIV）减毒活疫苗（HLIV）DNA疫苗————研究——研究Ⅰ期Ⅰ期（动物）研究研究Ⅰ期联合免疫多肽+痘病毒DNA+痘病毒研究研究Ⅰ期研究2乙肝疫苗—S亚单位颗粒（酵母）亚单位颗粒（CHO）亚单位颗粒（痘苗）载体活疫苗（痘苗）载体活疫苗（Ad）亚单位颗粒（植物）DNA疫苗引进生产生产Ⅰ期研究研究研究生产研究研究研究Ⅰ期Ⅰ期研究—S2+S亚单位颗粒（CHO）载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究生产研究研究—S1+S2+S亚单位颗粒（CHO）亚单位颗粒（酵母）载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究I期Ⅲ期研究研究—Epitop(S1,S2,S)载体活疫苗（沙门菌）研究I期—C亚单位颗粒（大肠）载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究3丙肝疫苗——C+E1+E2亚单位多肽（CHO）DNA疫苗研究研究研究研究4戊肝疫苗——ORF2,3亚单位多肽（大肠）亚单位多肽（酵母）亚单位多肽（昆虫）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究5呼吸道合胞病毒疫苗—F+G载体活疫苗（痘苗）载体活疫羁（Ad4）研究研究研究研究—F亚单位多肽（大肠）研究Ⅱ期6巨细胞病毒疫苗——完整病毒颗粒减毒活疫苗（Towne）基因缺失活疫苗————II期研究7单纯疱疹病毒疫苗——完整病毒颗粒基因缺失活疫苗——I期——gD,gB载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究8登革热病毒疫苗——Dengnel,2,3,4E,Prem-E,NS1,NS2减毒活疫苗分子减毒活疫苗亚单位多肽（痘苗）亚单位多肽（昆虫）亚单位多肽（原核）亚单位颗粒（痘苗）亚单位颗粒（昆虫）载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究研究Ⅱ期研究研究研究研究研究研究研究研究9乳头瘤病毒疫苗——L1、L2、E6、E7载体活疫苗（痘苗）亚单位颗粒（酵母）亚单位颗粒（昆虫）亚单位颗粒（原核）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究II期研究研究——E6、E7载体活疫苗（痘苗）研究I期10EB病毒疫苗——gp350,LMP1,LM2,C—Epitop载体活疫苗（痘苗）业单位多肽（合成）亚单位多肽（CHO）亚单位多肽（昆虫）免疫细胞苗（树突）DNA疫苗I期研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究11甲肝疫苗——ORF载体活疫苗（痘苗）亚单位颗粒（昆虫）I期研究研究研究——VP1，VP3亚单位多肽（大肠）载体活疫苗（polio）研究研究研究研究12麻疹疫苗—HA+F载体活疫苗（ALVAC）载体活疫苗（痘苗）DNA疫苗——I期研究I期研究研究—完整病毒基因缺失活疫苗研究研究13出血热疫苗—G1，G2，NP载体活疫苗（痘苗）载体活疫苗（Ad）亚单位颗粒（痘苗）亚单位颗粒（昆虫）研究研究研究研究I期——研究研究14小儿轮状病毒疫苗—人/猴病毒重组减毒活疫苗（重配）——IV期—人/牛病毒重组减毒活疫苗（重配）——III期—人/羊病毒重组减毒活疫苗（重配）IV期———VP4，VP7，VP6亚单位颗粒（昆虫）载体活疫苗（原核）载体活疫苗（痘苗）载体活疫苗（Ad）研究——研究研究研究研究研究研究15狂犬病疫苗—外膜糖蛋白载体活疫苗（痘病毒）研究IV期（动物）载体活疫苗（Ad）研究研究多价疫苗—DTP+HBV，DTP+IVP，DTP+IVP+HBVDTP+HBV+HAV联合疫苗（传统技术+基因工程）研究II期16—甲肝、乙肝、麻疹、RSV载体活疫苗（痘苗）多价DNA疫苗研究研究研究研究1、艾滋病（AIDS）疫苗（1）研究的三阶段：①最早使用其膜抗原gp120（Glucoseprotein120）②膜抗原加其他能诱发细胞免疫抗原的多抗原疫苗的复杂设计；③在泰国使用gp120亚单位疫苗数千人免疫接苗无效后，改为先用重组痘病毒ALVA（疫苗注射后），再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。（2）HIV感染特点：①HIV直接感染破坏免疫细胞；②HIV变异极快。（3）AIDS疫苗研究方向：①能诱发有效的中和抗体，阻止或大部阻止HIV感染免疫细胞；②能诱发强细胞免疫；③中和抗体屏障被部分突破时能有效清除被感染细胞，是研究中应统筹考虑的。2、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（1）目前存在的问题：人群中约10%左右对现有乙肝疫苗（仅含S抗原的疫苗）无反应；（2）研制方向：使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使对现有S乙肝疫苗无反应的人群产生良好的免疫反应。目前，含前S的疫苗，新佐剂乙肝疫苗，乙肝抗原抗体复合物疫苗，治疗性乙肝研究的热点。（3）丙型肝炎病毒（HCV）疫苗

丙型肝炎感染约占人群2%左右，也就是有2000多万感染者，大部分都会转为慢性，并导致肝硬化和肝癌，危害远大于乙肝。研究方向；①多数实验集中于使用病毒外膜蛋白E1+E2研制病毒样颗粒的亚单位疫苗和②使用载体进行重组活疫苗研究。③由于丙肝病毒变异快，极易冲破已有中和抗体的屏障，④选择变异不大且能诱发细胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。4、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗戊型肝炎病毒属杯状病毒科，单股正链RNA病毒，基因组全长约7.4kb。经消化道传播，暴发流行和散发两种，戊型肝炎的临床表现比甲型肝炎重。选择基因工程的手段研制戊型肝炎疫苗唯一的方法。基因工程疫苗主要采用原核细胞、酵母细胞和昆虫细胞三种表达体系。

我国目前以原核细胞和酵母细胞对戊型肝炎病毒结构蛋白均表达成功（张明程，1999）抗原性在世界范围内稳定，表明戊型肝炎病毒基因工程疫苗将对该病的预防具有良好的效果。

5、呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗

呼吸道合胞病毒属单股副链RNA病毒，是引起婴幼儿肺炎的主要病因。RSV保护性抗原主要是其糖蛋白F和G，高度糖化蛋白，抗原结构复杂，属结构依赖性抗原，产生中和抗体的能力都很差，给研制RSV蛋白亚单位疫苗带来了一定困难。

研制方向：目前研制的高度减毒的非复制型载体是研制该疫苗的重要途径；制备减毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一个重要途径，负链RNA病毒cDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望，也是目前RSV疫苗研制重要途径。6、人巨细胞病毒（HMV）疫苗（1）危害：HMV属疱疹病毒科，通常为隐性感染，无明显临床症状。然而HMV的潜伏感染将对人体健康造成极大威胁。（2）问题：该疫苗株虽能诱发体液和细胞免疫，但保护作用不强，且其潜在的致癌性，以及尚未能最终排除的潜伏感染性，使该类活疫苗尚未能广泛使用。（3）研制方向：

目前使用分子生物学技术，有目的地去除与与毒力、潜伏及肿瘤相关基因的分子减毒疫苗株正在研制中。基因工程技术表达的gB做亚单位疫苗或重组活疫苗的研究已成为目前HMV疫苗研究的一个重要方向。7、单纯疱疹病毒（HSV）疫苗（1）危害：单纯疱疹病毒有两种类型（HSVI和HSVII），在人群中感染相当广泛。HSVI人群感染率高到50%-90%，多为隐性潜伏性感染。母婴传播中疱疹性角膜炎视力障碍新生儿死亡率高达60%。在病毒性脑炎中，HSVI型感染引起的占10%。HSVII主要经过性传播，病毒检出率可达5%-12%。HSVII感染是宫颈癌的重要诱因之一。（2）方向：

病毒糖蛋白gD和gB是主要的保护性抗原，与gC、gE、gI联合使用可诱生体液和细胞免疫，在动物实验中，HSVIIgD的核酸疫苗可以保护动物免受感染及随后的潜伏感染，这些研究为单纯疱疹病毒疫苗的研究提供了有力的证据。8、登革热病毒疫苗（Denguefevervirusvaccine）（1）危害：登革热病毒属黄病毒科，为单股正链RNA病毒，有4个血清型，蚊子叮咬传播给人，在我国南方热带亚热带地区发生过多次登革热流行。（2）方向：

①通过表达prM-E形成病毒样颗粒的亚单位疫苗显示了较好安全性和免疫保护性，是该疫苗研究的重要方向。②使用该病毒感染性cDNA进行的分子减毒活疫及多种亚型嵌合的减毒活疫苗研究也取得了较好效果，是另一个重要途径。

9、人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）疫苗人乳头瘤病毒是环型双链dsDNA病毒，其中与宫颈癌密切相关的有HPV16、18、33、58等亚型。外壳蛋白L1和L2能诱发机体产生体液和细胞免疫，预防乳头瘤病毒感染；E6和E7是与细胞转化有关的蛋白，表达E6和E7的重组痘病毒疫苗能有效阻止HPV阳性的宫颈癌细胞生长和转移。表达HPV16和HPV18两型E6和E7的重组痘苗病毒已进行了小量人体观察，证明产生了部分抑制肿瘤生长的结果（1996）。L1和L2可在细菌、酵母及痘苗病毒载体中很好表达，并形成病毒样颗粒，有很好的安全性和免疫效果。治疗性疫苗以E6和E7为主，加上L1和L2可增强治疗性疫苗免疫效果。10、Epstein-Barr病毒（EB）疫苗（1）危害：EB病毒为疱疹病毒科，嗜淋巴细胞病毒属，感染广泛，90%以上成人都感染过此病毒。（2）方向：①阻断其原发感染；②清除鼻咽癌细胞。

（3）方法：前者主要以EBV的MA（如gp350）为免疫原，gp350亚单位疫苗和表达gp350的重组痘苗病毒活疫苗显示了一定抗瘤作用；后者主要以EBV的潜伏膜蛋白LMP1和LMP2为免疫原，进行了多肽、重组活疫苗、DNA疫苗免疫细胞疫苗等多种尝试。11、埃博拉病毒（EBV）疫苗vaccine）

埃博拉病毒是单股负链RNA病毒，属丝状病毒，致死率极高。致病机制尚不清楚，曾试用过灭活疫苗，效果不好，减毒疫苗存在危险性，至今尚未成功。

第四节疫苗生产工艺流程

菌（毒）种培养物（培养基、动物、禽胚或细胞等）收获抗原（培养液、含毒组织、胚液或细胞液等）配苗

分装冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。病毒性细胞疫苗的制造工艺流程健康动物（或胚胎）组织原料细胞悬液生长细胞病毒液配苗分装冻干、扎盖帖签活疫苗基础种毒生产用种毒原料保护剂配制灭菌细胞培养液传代细胞灭活病毒液配苗（混匀、乳化）分扎盖帖签装灭活疫苗检验原料佐剂配制灭菌灭活检验配制培养收获病毒性组织疫苗的制造工艺流程感染动物或胚胎分装、扎盖、贴签健康动物或SPF鸡胚等健康动物或SPF鸡胚等动物或SPF鸡胚等基础种毒生产用种毒收获感染组织或胚液纯化配制成含毒悬液配苗分装冻干活疫苗保护剂原料配制检验灭活病毒液配苗、乳化灭活疫苗原料佐剂配制灭活检验十万级洁净走道以马立克CVI988/Rispens为例，简述细胞苗生产工艺细胞制作1、选择孵育10天、发育良好的SPF鸡胚；2、胚体去头及内脏；3、加入胰蛋白酶，采取磁力搅拌的方法将鸡胚组织消化成单个的细胞；4、冷冻离心后，取细胞；5、将细胞加入培养液(进口试剂)，制成细胞悬液(加入进口血清)；6、将细胞悬液加入转瓶，置37℃培养；工艺介绍工艺介绍工艺介绍工艺介绍工艺介绍工艺介绍接毒1、细胞经37℃培养24小时，即可长成细胞单层；2、将种毒接入细胞单层（必要时需吸附30分钟左右）；3、加入培养液，置37℃培养。工艺介绍工艺介绍工艺介绍收获1、含毒细胞经培养60-72小时，病变达80%以上时即可收获；2、将转瓶中培养液弃去；3、加入胰酶-EDTA消化液（使细胞间结构疏松），将细胞单层消化成单个细胞；4、加入停消液终止消化；5、冷冻离心后取细胞，用冻存液悬浮。工艺介绍工艺介绍工艺介绍工艺介绍分装、冻存1、使用进口分装机，将含毒细胞的冻存液准确地分入安瓿瓶（悬液瓶置于磁力搅拌器上，确保均匀），装夹；2、将安瓿瓶放入液氮程序降温仪，采取特殊工艺使其降温至-70℃；3、将安瓿（夹）移入液氮（-196℃）保存。工艺介绍德国引进R921全自动安瓿灌封机从美国CBS公司引进程序降温仪液氮苗存放间全景以新城疫活疫苗（ZM10）为例简述组织苗生产工艺10万级净化条件下的鸡胚前孵化厂房(3)1、种毒选择必须选择SPF蛋制作种毒；种毒分为原始种毒、基础种毒、种毒批；胚体符合新城疫典型特征：头、肢、腹有出血点；心脏肿大，心尖有出点；胚液HA达512以上；效价达108.5EID50/0.1ml；无细菌、霉菌、支原体和外源病毒。2、选择鸡胚必须选择SPF蛋；产蛋日龄最好控制在２６周～５６周内；尽量采购３天以内的新鲜种蛋，最迟不超过七天；种蛋产出后４小时内进行熏蒸消毒，种蛋在１４～１８℃，相对湿度６５％左右最适；单枚蛋重４８～６０g之间，鸡蛋大小均匀一致；蛋壳质量：应选择表面致密，钙质分布均匀的种蛋，剔除沙壳，畸形，破壳及表面不清洁的种蛋．操作时要轻拿轻放；入孵前进行熏蒸消毒；孵化温度３７．５～３８．５℃，相对湿度５５～７０％；翻蛋次数一次／２小时；孵化至５～７日龄须照蛋，剔除不受精和死胚；孵化至10日龄备用。3、接种种毒将种毒作数万倍稀释；通过自动接种机，将种毒由鸡胚气室部位接入到尿囊腔内；用胶液将接种孔封闭；后孵化：温度36.5-37℃，相对湿度在60%左右；后孵化不翻蛋。4、收获将后孵至72-96小时的鸡胚置4℃冷却6小时；检查胚体是否符合新城疫典型特征：头、肢、腹有出血点；心脏肿大，心尖有出点；胚液HA达512以上；通过自动收获机收获鸡胚的尿囊液；收获的尿液经病毒浓缩设备进行4-10倍浓缩（产品的均一与稳定）；浓缩抗原再经除菌设备进行除菌。美国引进MILLIPORE病毒浓缩器5、中间检测效价检测：抗原效价必须达08.5EID50/0.1ml×浓缩倍数。无细菌、霉菌、支原体和外源病毒。6、配苗、分装、冻干、轧盖、贴标根据浓缩倍数、检测的效价和设计羽份确定配苗比例，以期产品的均一与稳定；用自动分装机进行定量分装（半加塞）；进入冻干机进行程序冻干（自由水和结合水）；冻干结束后，进行轧盖、贴标（先确定羽份）、包装（即时包装）。德国STERIS公司引进LYOVAC冻干机(1)德国引进BOSCH全自动疫苗分装线(1)德国引进BOSCH全自动疫苗分装线(2)德国引进BOSCH全自动疫苗分装线(3)7、成品检验物理性状检测剩余水分测定无菌检验支原体检验鉴别检验安全检验效力检验真空度检测耐老化检验外源病毒检验

第五节我国基因工程病毒疫苗的开发战略研究（Developmentstrategyofgeneengineeringvaccineinchina)一、首先要明确基因工程病毒疫苗在整个病毒疫苗研究开发中的地位和任务(Statusandtask)1主要常规技术不能或很难解决的新疫苗(Newgenerationvaccine)

①不能或难于培养的病原体；②有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体。2、传统疫苗的改造（(Reconstructionoftraditionalvaccine）主要针对免疫效果差，负反应大，成本较高和使用不方便的传统疫苗进行改造。3、加强治疗性疫苗研究

（Intensificationofcurevaccineresearch)近年来，使用疫苗进行疾病治疗的研究发展迅速，对引起慢性或持续性感染或与诱发肿瘤十分相关的病毒病，治疗性疫苗的研究将具有重要性。4、发展多价疫苗

多价疫苗成本低，免疫程序简单，是疫苗研究的发展方向。其发展方向为：

①使用基因工程技术对传统疫苗进行改造，获得联合疫苗；②发展具有高导入、高表达、强免疫、可加强的新型载体。二、目标的选择要以社会和市场需求为导向

1、研制预防我国严重病毒病的疫苗放在重点位置2、大力发展有市场前景新型疫苗

三、加强新型疫苗的基础研究

1、加强疾病免疫保护机制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanism）(1)选取病原体的某些抗原或某些抗原表位，或删除某些无用甚至有害的组分而构成的，因而必须了解这些抗原、表位或组分在病原体致病和免疫中的作用和机体对它们的应答。(2)一些发病和免疫机制比较简单的疾病已用常规疫苗解决了，留下的是一些比较复杂和较难解决的疾病或问题，例如呼吸道、肠道和生殖系统黏膜感染，其病原体常多型善变；易于产生持续感染基因整合的病毒；免疫病理机制不清的病毒；病原体结构复杂，发育阶段多，免疫保护作用不强；常规疫苗由于反应大，效果差或引起个别严重并发症，需用新型疫苗来代替。

2、加强新型疫苗的免疫保护机制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanismofnovelvaccine）新型疫苗抗原的免疫保护效果是新型疫苗研究的首要问题。活疫苗（包括基因工程活疫苗）最近似地模拟了感染后免疫，因而基因工程多肽疫苗和合成寡肽往往是用单一或少数几种保护性抗原，甚至单一个主要抗原表位代替完整的菌体或病毒颗粒。产生的两个问题：

第一，分子越小，其免疫原性越弱。因此多肽疫苗常需要用强有力的佐剂，以增强其免疫原性，合成寡肽则除了强佐剂以外，还要求偶联于一种载体蛋白上。

第二，产生的免疫仅针对一种抗原，甚至一个抗原表位，在免疫的综合性方面就与感染后免疫相差甚远，其有效保护程度和时间还需通过实践加以检验。

基因工程疫苗类型和表达系统的选择对获得有效的免疫保护常用关键性意义。新型疫苗的作用方式对机体的免疫系统产生重要影响。任何疫苗的作用机体的方式都不会与病原自然作用方式完全相同，因此必然产生新的免疫特点。在载体疫苗，特别是核酸疫苗中，这个问题尤为明显。在甲型流感的自然感染中，不同亚型间的共同抗原核蛋白无中和活性，也不能产生亚型间交叉保护。3、提高新型疫苗免疫效果(Enhancetheimmuneeffectofnewvaccine)基因工程多肽或寡肽疫苗成败的关键是如何克服免疫原性弱、免疫综合性差的问题。（1）多抗原表达（Multi-antigenexpression)新型疫苗的一个趋向是应用二个以上抗原。第一类都是表面抗原（2种以上）；第二类是同时用表面与内部抗原诱生中和抗体；第三类是用表面抗原与非结构蛋白。（2）颗粒性抗原(Granularantigen)①在体外将多肽聚团化可形成100nm左右颗粒，如加入皂角糖苷（QuilA）可形成“免疫刺激复合物”（Immunostimulatingcomplex，ISCOM）；②将抗原包入脂质体内可形成免疫脂质体。

③应用基因工程或化学交联方法将B细胞表位结合到HbsAg,核心Ag或轮状病毒核心表面，以增强免疫原性，特别是HbcAg具有T细胞依赖性和非依赖性免疫作用，是较为理想的颗粒型载体。④有些病原结构基因的表达可产生不含核酸的病毒样颗粒，人类细小病毒B19株的壳蛋白可形成空心外壳；在痘苗中同时表达HIV的gag和env基因可形成类似病毒的颗粒。（3）蛋白质工程抗原

①多个寡肽串联成“鸡尾酒式疫苗”是首先针对恶性疟原虫而提出的，是将多个不同的B细胞表位和多个TH细胞表位串联起来，同时删除可能存在的抑制性T细胞（suppressorTcell，Ts）表位。②另一个也属于蛋白质工程范畴，是将本来在细胞内表达的抗原加以改造，使之表达于细胞膜表面，以增强其免疫原性。此外，将RSV的两个表面抗原G和F组合成一个蛋白质的研究也相当深入，组合似不影响到它们各自的抗原特异性。（4）载体疫苗系统(Vectorvaccinesystem)

①基于病毒的载体活疫苗；②基于质粒DNA的非病毒载体疫苗。前者方向是“非复制型”载体，需克服不安全性和不易加强使用的缺点；后者方向是改进导入效率、提高抗原表达、增强免疫反应强度、克服潜在的致癌及免疫病理作用。其优点是：廉价、高效、易于组合成多价疫苗，是新型疫苗的重要组成部分。其缺点是：①尽管用于载体研究的这些微生物都是疫苗株，但做为活疫苗载体，可能产生接种副反应。②机体内针对载体的抗体，不论是免疫前存在的，或是免疫后产生的，都会对相应载体疫苗的再次使用产生一定影响，从而影响其免疫效果。（5）免疫佐剂与联合免疫

①强有力大都胞壁二肽的衍化物，如Syntex佐剂对多肽和寡肽都有很强的佐剂作用，能诱生抗体和细胞介导免疫，甚至超过了福氏完全佐剂，且无热源性，不引起肉芽肿、关节炎或其他组织损害。在用HCG-的37肽作为避孕疫苗进行人体实验时使用了这类佐剂。②淋巴因子如胸腺肽、白细胞介素-2、γ-干扰素等均曾用于免疫增强目的。IL-2似乎只对某些抗原有佐剂作用，且须每天注射。

③缓慢释放抗原的微胶囊（microsphere），虽不是佐剂，却能增强免疫效果。例如丙交酯与乙交酯共聚物，颗粒可达至3mm，小至1μm。④Al（OH）3依然独占鳌头。佐剂不但是亚单位疫苗成功的关键，而且还可通过选择不同的佐剂改变疫苗免疫反应类型，增加疫苗用途，提高新的免疫接种途径。

不同类型疫苗联合应用，以达互补效果，是近年一些难度较大疫苗研制的新途径。

第三节分析文体特征和表现手法2大考点书法大家启功自传赏析中学生，副教授。博不精，专不透。名虽扬，实不够。高不成，低不就。瘫偏‘左’，派曾‘右’。面微圆，皮欠厚。妻已亡，并无后。丧犹新，病照旧。六十六，非不寿。八宝山，渐相凑。计平生，谥曰陋。身与名，一起臭。【赏析】寓幽默于“三字经”，名利淡薄，人生洒脱，真乃大师心态。1.实用类文本都有其鲜明的文体特征，传记的文体特征体现为作品的真实性和生动性。传记的表现手法主要有以下几个方面：人物表现的手法、结构技巧、语言艺术和修辞手法。2.在实际考查中，对传记中段落作用、细节描写、人物陪衬以及环境描写设题较多，对于材料的选择与组织也常有涉及。3.考生复习时要善于借鉴小说和散文的知识和经验，同时抓住传记的主旨、构思以及语言特征来解答问题。传记的文体特点是真实性和文学性。其中，真实性是传记的第一特征，写作时不允许任意虚构。但传记不同于一般的枯燥的历史记录，它具有文学性，它通过作者的选择、剪辑、组接，倾注了爱憎的情感；它需要用艺术的手法加以表现，以达到传神的目的。考点一分析文体特征从哪些方面分析传记的文体特征？一、选材方面1.人物的时代性和代表性。传记里的人物都是某时代某领域较

突出的人物。2.选材的真实性和典型性。传记的材料比较翔实，作者从传主

的繁杂经历中选取典型的事例，来表现传主的人格特点，有

较强的说服力。3.传记的材料可以是重大事件，也可以是日常生活小事。[知能构建]二、组材方面1.从时序角度思考。通过抓时间词语，可以迅速理清文章脉络，

把握人物的生活经历及思想演变过程。2.从详略方面思考。组材是与主题密切相关的。对中心有用的，

与主题特别密切的材料，是主要内容，则需浓墨重彩地渲染，

要详细写；与主题关系不很密切的材料，是次要内容，则轻

描淡写，甚至一笔带过。三、句段作用和标题效果类别作用或效果开头段内容：开篇点题，渲染气氛，奠定基调，表明情感。结构：总领下文，统摄全篇；与下文某处文字呼应，为下文做铺垫或埋下伏笔；与结尾呼应。中间段内容：如果比较短，它的作用一般是总结上文，照应下文；如果比较长，它的作用一般是扩展思路，丰富内涵，具体展示，深化主题。结构：过渡，承上启下，为下文埋下伏笔、铺垫蓄势。结尾段内容：点明中心，深化主题，画龙点睛，升华感情、卒章显志，启发思考。结构：照应开头；呼应前文；使结构首尾圆合。标题①突出了叙述评议的对象。②设置悬念，激发读者的阅读兴趣。③表现了传主的精神或品质。④点明了主旨，表达了作者的情感。⑤运用修辞，使文章内涵丰富，意蕴深刻，增加了文章的厚度与深度。四、语言特色角度分析鉴赏传记的类别自传采用第一人称，语言或幽默调侃或自然亲切；他传采用第三人称，语言或朴实自然或文采斐然。语意和句式句子中的关键词所包含的情感、态度等，整句与散句、推测与肯定、议论与抒情、祈使与反问等特殊句式，往往有着不同一般的表现力。这些都是分析语言的切入点。修辞的角度修辞一般是用来加强语言的表现力的。抓住修辞特点，就能从语言的表达效果上加以体味。语言风格含蓄与明快、文雅与通俗、生动与朴实、富丽与素淡、简洁与繁复等。1.(2015·新课标全国卷Ⅰ)阅读下面的文字，完成后面的题目。[即学即练]朱东润自传1896年我出生在江苏泰兴一个失业店员的家庭，早年生活艰苦，所受的教育也存在着一定的波折。21岁我到梧州担任广西第二中学的外语教师，23岁调任南通师范学校教师。1929年4月间，我到武汉大学担任外语讲师，从此我就成为大学教师。那时武汉大学的文学院长是闻一多教授，他看到中文系的教师实在太复杂，总想来一些变动。用近年的说法，这叫作掺沙子。我的命运是作为沙子而到中文系开课的。大约是1939年吧，一所内迁的大学的中文系在学年开始，出现了传记研究这一个课，其下注明本年开韩柳文。传记文学也好，韩柳文学也不妨，但是怎么会在传记研究这个总题下面开韩柳文呢？在当时的大学里，出现的怪事不少，可是这一项多少和我的兴趣有关，这就决定了我对于传记文学献身的意图。《四库全书总目》有传记类，指出《晏子春秋》为传之祖，《孔子三朝记》为记之祖，这是三百年前的看法，现在用不上了。有人说《史记》《汉书》为传记之祖，这个也用不上。《史》《汉》有互见法，对于一个人的评价，常常需要通读全书多卷，才能得其大略。可是在传记文学里，一个传主只有一本书，必须在这本书里把对他的评价全部交代。是不是古人所作的传、行状、神道碑这一类的作品对于近代传记文学的写作有什么帮助呢？也不尽然。古代文人的这类作品，主要是对于死者的歌颂，对于近代传记文学是没有什么用处的。这些作品，毕竟不是传记文学。除了史家和文人的作品以外，是不是还有值得提出的呢？有的，这便是所谓别传。别传的名称，可能不是作者的自称而是后人认为有别于正史，因此称为“别传”。有些简单一些，也可称为传叙。这类作品写得都很生动，没有那些阿谀奉承之辞，而且是信笔直书，对于传主的错误和缺陷，都是全部奉陈。是不是可以从国外吸收传记文学的写作方法呢？当然可以，而且有此必要。但是不能没有一个抉择。罗马时代的勃路塔克是最好的了，但是他的时代和我们相去太远，而且他的那部大作，所着重的是相互比较而很少对于传主的刻画，因此我们只能看到一个大略而看不到入情入理的细致的分析。英国的《约翰逊博士传》是传记文学中的不朽名作，英国人把它推重到极高的地位。这部书的细致是到了一个登峰造极的地位，但是的确也难免有些琐碎。而且由于约翰逊并不处于当时的政治中心，其人也并不能代表英国的一般人物，所以这部作品不是我们必须模仿的范本。是不是我国已经翻译过来的《维多利亚女王传》可以作为范本呢？应当说是可以，由于作者着墨无多，处处显得“颊上三毫”的风神。可是中国文人相传的做法，正是走的一样的道路，所以无论近代人怎么推崇这部作品，总还不免令人有“穿新鞋走老路”的戒心。国内外的作品读过一些，也读过法国评论家莫洛亚的传记文学理论，是不是对于传记文学就算有些认识呢？不算，在自己没有动手创作之前，就不能算是认识。这时是1940年左右，中国正在艰苦抗战，我只身独处，住在四川乐山的郊区，每周得进城到学校上课，生活也很艰苦。家乡已经陷落了，妻室儿女，一家八口，正在死亡线上挣扎。我决心把研读的各种传记作为范本，自己也写出一本来。我写谁呢？我考虑了好久，最后决定写明代的张居正。第一，因为他能把一个充满内忧外患的国家拯救出来，为垂亡的明王朝延长了七十年的寿命。第二，因为他不顾个人的安危和世人的唾骂，终于完成历史赋予他的使命。他不是没有缺点的，但是无论他有多大的缺点，他是唯一能够拯救那个时代的人物。(有删改)【相关链接】①自传和传人，本是性质类似的著述，除了因为作者立场的不同，因而有必要的区别以外，原来没有很大的差异。但是在西洋文学里，常会发生分类的麻烦。我们则传叙二字连用指明同类的文学。同时因为古代的用法，传人曰传，自叙曰叙，这种分别的观念，是一种原有的观念，所以传叙文学，包括叙、传在内，丝毫不感觉牵强。(朱东润《关于传叙文学的几个名词》)②朱先生确是有儒家风度的学者，一身正气，因此他所选择的传主对象，差不多都是关心国计民生的有为之士。他强调关切现实，拯救危亡，尊崇气节与品格。这都是可以理解的。(傅璇琮《理性的思索和情感的倾注——读朱东润先生史传文学随想》)★作为带有学术性质的自传，本文有什么特点？请简要回答。答：________________________________________________解析本题考查分析文本的文体基本特征和语言特色。解答时，要在阅读的基础上，了解文章的文体特征、内容的侧重点、内容表达的特征。本文作为一篇带有学术性质的自传，突出特点之一就是偏重学术经历，介绍了自己的传记文学观及其形成过程。文章的开头与结尾，将自己的生平与学术结合起来，尤其是为张居正写传原因的解说，结合当时的社会背景和自己家庭的情况，更是呈现出学术背后的家国情怀。在行文方面，语言平易自然，穿插“怎么会在传记研究这个总题下面开韩柳文呢？”“我写谁呢？”等口语，语言平白如话，就像面对面闲谈一样。答案①偏重学术经历，主要写自己的传记文学观及其形成过程；②写生平与写学术二者交融，呈现学术背后的家国情怀；③行文平易自然，穿插使用口语，就像和老朋友闲谈一样。1.一般和具体结合我们在对文本的一般性特征进行分析的同时，也应该注意到富有个性的“具体”的特征。[思维建模]分析文体特征2要领2.注意效果解读

分析文体特征时，不能仅仅停留在辨别认知的层面上，而必须懂得去对它们做“效果”分析。对“效果”的分析不外乎从这样的两个方面去考虑：一是从表达者的表达这个方面去考虑，看他采用这样的方式会给他的表达带来怎样的好处；二是从阅读者这个方面考虑，看他这样做可以对读者的阅读产生什么样的积极的效果。分析传记的文体特征☞咀嚼经典高考题目提升审题答题技能高考曾经这样考品答案，悟技巧，不丢分1.(2014·辽宁卷)本文第一自然段有何作用？请简要分析。(6分)(《侯仁之：城市的知音》)①交代侯仁之选择历史专业的原因；②写出了侯仁之对国家民族命运的关注，使传主形象更加丰满；③体现了传记的真实性；④为下文介绍侯仁之的学术研究及成就做铺垫。(答出1点给1分，2点给3分，3点给5分，4点给6分)2.(2013·福建卷)文章已有“《梦里京华》”一例，为何还要例举“委曲求全”？请简要分析。(4分)(《那一种遥远的幽默》)①增强说服力，进一步突出王文显剧作别有一番幽默，肯定他喜剧创作的能力和影响。②引出下文对王文显任代理校长时行事风格的叙写，形成对比，以突出王文显治校的持重务实，一丝不苟。(每点2分，意思对即可。)3.(2012·新课标全国卷)12(1)选项E：本文撷取谢希德人生的若干片断，描写她热爱祖国、献身科学、关爱亲人的事迹，表现了一位杰出女性的伟大人格。(√)(《谢希德的诚与真》)本选项考查对文体特征的理解，涉及文章的选材、文本的主要内容与主题等内容。(正确选项，3分)因传记是记载人物生平或事迹的一类记叙文体，它的表达技巧比较接近于小说和散文，可以说文学类文本的表现手法都与传记相通。由于传记的文体特征，需要格外注意其他人物对传主的映衬、细节描写、引用和议论等方面。考点二分析表现手法3题型(一)叙述1.顺叙的作用(效果)：思路清晰，结构条理。2.倒叙的作用(效果)[知能构建](1)能增强文章的生动性，使文章产生悬念，更能引人入胜。(2)强调作用，这一段主要写了……放到开头强调了传主的……(与传主精神、品质等的关系)。(3)表达了作者对传主怎样的情感(与作者情感的关系)。(4)深化了主旨(与主旨的关系)。(5)使文章结构富于变化，避免了叙述的平淡和结构的单调。3.插叙的作用(效果)(1)内容上：①(如果是引述他人的话，或是传主自己的话、书信等)突出了传记的真实性，使文章内容更充实。②深化了文章主题。③使人物形象更加鲜明。④(如果是引述他人的话等就属于侧面描写)侧面烘托了传主的……⑤(如果插叙的语段拿传主和其他人对比)通过对比，衬托出了传主的……(2)结构上：①避免了结构的平铺直叙，使行文起伏多变，使结构更加紧凑集中。②对……做了必要的铺垫照应，补充说明。(二)描写(主要是细节描写)1.描写的三种作用(1)让传主形象更全面完整，更立体化。传主形象是由多个侧面组成的，只表现其伟大的一面，而不展现其普通的一面，人物就不能立体化。

(2)让人物真实可信。要把人物写好，就要写其普通的一面，因为读者是普通的公民，他愿意接受伟人身上普通的一面。这样的人物会让读者觉得真实亲切，易于接受。(3)符合读者心理需要。对于大人物诸如政治家、艺术家、影视明星等，读者已经从媒体中了解了一些他们在本行业内的成就、事迹。对于传记作品，读者更渴望了解一些花絮。因此，一些细节正能解决这一问题。2.两种答题方式(1)如果是写人物的细节，可以这样：①思维趋向：写人物的细节＝细节内容＋独特形象＋表现主题＋读者心理。②答题方式：通过描写…