第7章-微生物遗传与菌种选育课件

遗传变异的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种（自学）基因工程菌种的衰退复壮和保藏内容提要

第七章微生物遗传与菌种选育理想的工业发酵菌种应符合以下要求①遗传性状稳定；②生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；③目标产物的产量尽可能接近理论转化率；④目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；⑤尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分离；⑥培养基成分简单、来源广、价格低廉；⑦对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；⑧对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。理想的工业发酵菌种应符合以下要求微生物是遗传学研究的最好材料和对象1、微生物结构简单2、营养体一般都是单倍体3、微生物繁殖速度快6、存在多种方式的繁殖类型5、环境条件对微生物作用直接均匀4、易积累不同的中间及最终代谢产物7、微生物的变异易被识别8、参与基因工程的载体、供体、受体三种角色微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。研究微生物遗传学的意义

遗传型——又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因的总和。

表型——指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。

遗传型+环境条件表型

变异——生物体在某种内因或外因的作用下，引起的遗传物质结构或数量的变化。变异的特点：在群体出现的几率极低（10-5-10-10），变化后的新性状可遗传。

饰变

——不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。表型饰变：表型的差异只与环境有关，特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。斜面培养液体培养第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883－－1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。FCrick在研究DNA双螺旋结构基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验肺炎球菌的转化试验噬菌体感染试验病毒的拆开与重建试验人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质转化实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式一、3个经典实验光滑型（S）粗糙型（R）有荚膜菌落光滑分泌毒素致病无荚膜菌落粗糙无毒不致病实验材料：肺炎双球菌（一）转化实验说明：加热杀死的S型细菌中有一种具有遗传转化能力的物质，它通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达S型荚膜形状的遗传特性1928年Griffith进行的细菌转化实验①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明：S型菌株转移给R型菌株的DNA是遗传因子。（二）噬菌体感染实验（p188）蛋白质只含S不含PDNA只含P不含S原理步骤1：用含同位素Ｓ35,

P32的培养基分别培养大肠杆菌2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35

、P32标记（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含75%放射性为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。（三）植物病毒的重建实验（p189）

植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.植物病毒的重建实验

甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒

TMVHRVHRVTMV原始株拆开重建感染分离纯化

植物病毒的重建实验

遗传物质类型核染色体核外染色体真核生物细胞器原核生物质粒二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式核外DNA的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒

线粒体细胞质基因 叶绿体 中心体 动体共生生物：卡巴颗粒酵母菌的2m质粒F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒（一）核酸存在的7个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平:

原核与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平:

倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录——翻译密码子水平：信息单位,起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基染色体基因Ⅱ基因ⅠDNA基因是一段DNADNA就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序就是读出A-C-G-T-G-G-A-C-G…...基因控制Pr因而控制性状GATCTAGAUDNAmRNA天冬氨酸

基因是什么？基因决定生物体的生、长、病、老死等一切生命现象基因是生命的密码。。基因记录和传递遗传信息。大肠杆菌基因组4100个基因，4.7×106bp遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构基因单拷贝及rRNA多拷贝基因的重复序列少而短酵母菌基因组染色体长度Kb基因数12345678染色体长度Kb基因数439745666107892478410929482304231738142921365732912313873345504874215714991310271310331110241622211520174原核生物基因调控系统（p193）操纵子RP

O结构基因启动基因操纵基因调节基因（二)原核生物的质粒（p194）功能：带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等，并可进行细胞间转移。结构与大小：质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子状态存在于细胞中。约为1～1000kb，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。定义：存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。质粒核外环状小型DNA独立复制稳定遗传F因子与有性接合有关种类

R因子与抗药性有关COL编码免疫蛋白Ti质粒诱癌质粒降解性质粒：编码降解有害物质的酶用途基因工程中作为目的基因载体质粒原核生物遗传物质存在的另一种方式基因突变突变与育种第二节基因突变和诱变育种突变的特点基因突变诱变机制突变率突变类型条件致死突变型（株）（一）突变类型突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型（株）抗性缺陷型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）按方法分：按突变株的表型是否能在选择性培养基上加以鉴别来区分。微生物突变体的主要类型形态突变型生化突变型营养突变体(营养缺陷型)发酵突变体抗性突变体条件致死突变体抗原突变型产量突变型按突变实质分营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。野生型和缺陷型分别用+、-表示，如分别用his+和his-表示组氨酸野生型和缺陷型。抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。抗性和敏感型分别用r和s表示，如用strr和strs分别表示链霉素抗性和敏感性。条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。（温度敏感突变株ts）形态突变型——细胞形态变化或菌落形态变化。如菌落颜色变化，菌体失去荚膜、鞭毛等。（三)基因突变的特点（p200）不对应性自发性稀有性独立性诱变性稳定性可逆性基因（自发）突变的特点：自发性：是不经诱变剂处理而自然发生的突变。突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的几率。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数稀有性：突变率低且稳定。不对应性：突变的发生与环境因子之间无直接的对应关系。

若干细菌某一性状的自发突变率菌名 突变性状 突变率E.coli

抗T1噬菌体 3×10–8E.coli

抗T3噬菌体 1×10–7

E.coli

不发酵乳糖 1×10–10E.coli

抗紫外线 1×10–5Staphylococcusaureus

抗青霉素 1×10–7S.aureus

抗链霉素 1×10–9

Salmonellatyphi

抗25g/L链霉素 1×10–6

Bacillusmegaterium

抗异烟肼 5×10–5可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forwardmutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（backmutation或reversemutation）。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。（四）基因突变自发性和不对应性的证明变量试验涂布试验影印培养试验变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养)

3714435抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验

涂布试验涂布敏感菌5×104个共12个平板5×104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后喷入T1保温6个平板共353个菌落6个平板共28个菌落涂布试验中突变率的计算初始接种量：5×104个/皿培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100×5×104≈2.6×108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率=28/15.6×108=1.8×108影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验原始敏感菌种影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958（五）基因突变及机制p2021.诱发突变：人为地用物理、化学、生物的方法处理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型的目的。诱变机制物理诱变剂：紫外线（UV）、X射线、λ射线、离子束、热等。生物诱变因子：转座子、温和性噬菌体等。化学诱变剂：碱基类似物：5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤插入染料：易引起移码突变，如溴化乙锭、丫啶橙与碱基起反应的诱变剂：硫酸二乙脂（DES，碱基烷基化）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸等。诱变剂：人工诱变时用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因素，又称诱变剂。诱变机制移码突变染色体畸变

碱基的置换

（1）碱基的置换直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂碱基的置换COHT：烯醇式CT：酮式OA..TT..

AG..

CA..T酮式T..

G烯醇式（2）移码突变ＤＮＡ分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一个碱基缺少一个碱基（3)染色体畸变

某些理化因子，如Ｘ射线，紫外线，亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。染色体畸变紫外线诱变作用机理1、使ＤＮＡ链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联2、引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂3、使胸腺嘧啶成二聚体，使ＤＮＡ结构发生改变二、突变与育种（p208）（一）自发突变与育种1.从生产中选育2.定向培育优良品种（二）诱变育种从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种的原则

效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)100250500～850～850～8000～2万～5万5～10万从青霉素产量看诱变育种1.诱变育种的基本环节（p209）大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产出发菌株计算出诱变2.诱变育种工作中应考虑的几个原则选优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂处理单孢子（或单细胞）悬液选用最适剂量设计或采用高效筛选方案或方法利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标（1）选择简便有效的诱变剂出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株S.t.his回变S.t.his吸入滤纸片保温可疑“三致”试样鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性利用回变检测致癌剂

——艾姆斯试验法（p210）平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高；在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致癌物时间3天，准确率85%。（2）挑选优良的出发菌株（p211）生产中用过的自发变异菌株采用具有有利性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用前体或最终产物代谢高的菌株采用增变菌株（3）处理单孢子（或单细胞）悬液芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜（4）选用最适剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量（5）充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落（7）设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株40株40株40株40株40株诱变剂处理3.突变株的筛选方法(p212）高产突变菌株的筛选方法抗性突变体的筛选方法营养缺陷型的的筛选方法与突变株的筛选相关的几个概念突变春日霉素产生菌的孢子悬液·高产突变株的筛选

琼脂块培养法筛选

春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板(2)抗性突变体的筛选方法青霉素浓缩法梯度培养皿法青霉素浓缩法培养基(含青霉素)

接入敏感菌液（含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培养(3)营养缺陷型的筛选(p214)

基本培养基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。完全培养基（CM）[+]：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。补充培养基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。与筛选营养缺陷型突变株相关的3类培养基三类遗传型野生型[A+B+]营养缺陷型型[A+B-]原养型[A+B+]与营养缺陷型突变相关的3类遗传型个体

（p215）

★与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-，bio-

野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。

如：lys+;bio+;原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。营养缺陷型的筛选办法

(p215)1.诱变剂处理2.淘汰野生型3.检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐渐检出法影印接种法4.鉴定缺陷型菌丝过滤法突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法夹层培养法（p216）夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）限量补充培养法微量蛋白质的完全培养基上小菌落是营养缺陷型突变株逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型逐个检出法缺陷型的检出影印接种法完全培养基影印接种基本培养基营养缺陷型菌丝过滤法筛选营养突变株基本培养基

接入微生物孢子（含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株菌丝过滤法适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。①生长谱法方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片补充：缺陷型的鉴定测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；组合营养物法步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种营养因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；一组：1

2345

二组：26

789

三组：3710

1112

四组：4811

1314

五组：59121415营养因子分组编排时注意；1）每组内无重复的营养因子2）每组中应包含只出现一次的因子3）每组中其他因子应分别出现二次如：一组：1

2345

二组：26

789

三组：3710

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四组：4811

1314

五组：59121415②组合补充培养基法将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷类型，或快速分离出所需缺陷类型的菌株。ABFEDCHG缺陷型的应用作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；作为aa、维生素、碱基的测定菌株。一、微生物菌种的衰退二、微生物菌种的复壮三、微生物菌种的保藏第五节微生物菌种的衰退、复壮和保藏P.231衰退的含义：由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。一、微生物菌种的衰退

衰退的表现形式

1）原有的形态不典型

2）生长速度变慢

3）代谢产物生产能力下降

4）致病力下降

5）抗性下降（一）衰退的防止方法1）控制传代的次数

2）创造良好培养条件3）采用有效的菌种保藏方法

4）采用不易衰退的细胞进行传代

P.232复壮的含义（二）