藏药吉妥明目方对糖尿病视网膜病变大鼠肠道菌群的影响

藏药吉妥明目方对糖尿病视网膜病变大鼠肠道菌群的影响

糖尿病是世界上最常见的代谢性疾病，其发病率逐年增加。根据国际糖尿病联盟（national糖尿病联盟）的研究结果，2017年，世界上的成人糖尿病患者达到了4.51亿。吉堪明目方是一种常用的藏成药，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》第1册，由小檗皮、红花、诃子、塞北紫堇、打箭菊、窄叶鲜卑花等组成，主要用于眼部疾病的治疗1材料表面1.1实验动物及原料SPF级健康SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030。本研究获得成都中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号：TCM-2016-312)。1.2用羟苯磺酸钙胶囊提取吉堪明目方浸膏冻干粉，由青海大学藏医学院提供，主要成分为小檗皮、红花、诃子、塞北紫堇、打箭菊、窄叶鲜卑花等(提取工艺采取单味药材分别采用不同浓度的乙醇加热提取后，滤渣再加水加热提取的双提法提取，减压浓缩至稠浸膏提取物，再将稠浸膏提取物混合均匀后冷冻干燥制成粉末状，即得)；羟苯磺酸钙胶囊(北京京丰制药集团，批号：180316；规格：每粒0.5g)。1.3试剂链脲佐菌素(Sigma公司，批号：WXBC3087V；纯度≥98%);0.1mol·L1.4成像设备和检测方法Varioskan型全波长多功能酶标仪(美国ThermoFisher公司)；RM2235型石蜡切片机、DM1000显微成像系统(德国Leica);RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；EclipseC1正置荧光显微镜、NikonDS-U3成像系统(日本尼康)；Image-proPlus6.0图像分析系统(美国MediaCybernetics);9700型PCR扩增仪(美国ABI);HiSeq2500基因测序分析系统(美国Illumina)。2方法2.1动物的造模训练将120只SD♂大鼠适应性喂养7d，随机选取12只作为空白对照组，普通饲料喂养，其余动物高脂饲料喂养，5周后，将所有动物禁食12h后一次性腹腔注射50mg·kg2.2模型分组及分组糖尿病大鼠成模3个月后，除去死亡及血糖不合格的糖尿病大鼠，将剩余35只糖尿病大鼠按照体质量和血糖分层后随机分为模型对照组、羟苯磺酸钙胶囊(0.05g·kg2.3大血清中的sod、ican-1和alg水平2.4组织病理学检测给药结束后，取大鼠眼球组织，经4%多聚甲醛溶液固定，采用不同比例乙醇进行组织脱水，二甲苯透明后，常规透蜡、包埋，苏木素和伊红(HE)染色，于显微镜下观察组织病理学变化。2.5视网膜血管形态观察给药结束后，取大鼠眼球组织，甲醛溶液固定，分离视网膜后，纯水冲洗24h，置于3%胰蛋白酶溶液中孵育消化，清洗多余组织至仅剩透明的视网膜血管网，将其取出行PAS染色，在显微镜下观察视网膜血管形态。2.6抗检测切片的制备给药结束后，取大鼠视网膜组织，石蜡包埋，切片，常规脱蜡，置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min转中低火7min，自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min；在圈内滴加BSA孵育30min；轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜后，用PBS(pH7.4)洗涤3次。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min后，用PBS洗涤3次。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；玻片置于PBS中晃动洗涤3次。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片；切片于荧光显微镜下观察并采集图像，每组内每张切片随机挑选至少3个400倍视野进行拍照。细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光；应用ImageProPlus6.0软件将绿色/红色荧光单色照片转换为黑白图片然后选取相同的黑色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。2.71pcr扩增检测及序列分析给药结束后，取大鼠新鲜粪便，对样本进行DNA纯化后，按指定测序区域，合成带有Barcode的特异引物(Primer5’→3’:515F(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对样本的16SrDNAV4区域进行扩增，每个样本进行3个重复，每个PCR反应终止于线性扩增期，PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后进行电泳检测，使用胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-EDTA缓冲液洗脱回收目标DNA片段；参照电泳初步检测结果，将PCR回收产物用Qubit2.0进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合；使用TruSeqDNAPCR-FreeSamplePrepKit进行文库构建后，采用PE250测序方式测序；将测序得到的原始下机数据经过拼接，过滤得到可供后续分析的高质量目标序列；序列拼接后，根据Barcode区分样品。去除低质量序列以及嵌合体后，在97%的相似性水平上进行操作分类单元(OperationalTaxonomicUnits,OTU)的聚类。挑选出OTU的代表性序列，使用SILVA数据库进行物种分类信息的划分，对代表性序列进行比对并过滤，然后重构建进化树，过滤掉不需要的OTU并进行重抽样；计算各个分类水平上的丰度信息后，进行群落组成分析、Alpha多样性分析等。2.8单因素方差分析数据统计采用SPSS19.0、GraphPadPrism7与TheUnscramblerX10.4软件进行分析，数据均以xuf0b1s表示，组间比较采用单因素方差分析。并采用TheUnscramblerX10.4对所有45个样本、14个指标数据(“2.3”“2.6”项下指标和末次给药后的体质量值、血糖值，以及肠道菌群中Helicobacter、ChristensenellaceaeR-7group、Proteus、Enterobacter、Lactobacillus、Bacteroides、Ruminococcus1的丰度情况)进行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)。3结果3.1造资单次造模后大鼠体质量和血糖水平空白对照组大鼠饮食、饮水正常，行动自如，毛色光洁，精神状态良好。造模组大鼠出现典型的“三多一少”症状，行动缓慢，毛色枯黄，精神状态萎靡。造模后1个月，与空白对照组相比，造模组大鼠体质量差异显著(P<0.01)；在其后的几个月内，造模组大鼠体质量增长趋势明显低于空白对照组大鼠(P<0.01)。造模后1个月，造模组大鼠血糖水平明显升高(P<0.01)，且一直维持在较高水平，空白对照组大鼠血糖水平较稳定。结果见表1～2。3.2吉采用明目方空白对照组大鼠体质量随月龄增加而逐渐增长，模型对照组大鼠体质量增长缓慢(P<0.01)。吉堪明目方各组给药4周后，大鼠一般状态好转。与模型对照组比较，吉堪明目方各给药组体质量变化无明显差异，但羟苯磺酸钙及吉堪明目方各组给药后体质量增长趋势高于模型对照组；空白对照组大鼠血糖始终维持在较低水平，与空白对照组比较，模型对照组血糖始终维持在较高水平(P<0.01)。与模型对照组比较，羟苯磺酸钙及吉堪明目方中、低剂量组血糖变化无显著差异。结果显示吉堪明目方无明显降低模型大鼠血糖的作用。结果见表3～4。3.3吉堪明目方对dr大鼠血清sod、程序的影响模型对照组大鼠血清中SOD、ICAM-1、ANGⅡ含量与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，吉堪明目方各给药组血清中SOD变化无显著差异；与模型对照组比较，高、中剂量吉堪明目方均可降低模型大鼠血清中ICAM-1的含量，其中吉堪明目方中剂量组大鼠血清中ICAM-1含量与模型对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；同时，高、中、低剂量吉堪明目方均可显著降低模型大鼠血清中ANGⅡ的含量(P<0.01)。结果见表5。3.4吉采用明目方对视网膜神经节细胞形态的影响空白对照组视网膜组织结构各层排列整齐，结构完整，均未见明显异常；视网膜连续且光滑，神经纤维层排列整齐，神经节细胞层细胞核较大，为单层排列，无明显异常，内核层、外核层细胞核排列整齐，形态正常。外丛状层和内丛状层染色均一，结构完整。模型对照组视网膜神经节细胞排列紊乱，数目减少，神经纤维层肿胀，可见毛细血管扩张淤血，内界膜脱落情况严重。与模型对照组比较，羟苯磺酸钙胶囊及吉堪明目方各剂量组神经纤维层肿胀程度明显减轻，毛线血管扩张淤血情况明显好转。其中，吉堪明目方高剂量组、羟苯磺酸钙胶囊组的神经纤维层恢复情况最好，毛细血管形态最接近于空白对照组，且羟苯磺酸钙胶囊组的内界膜脱落情况得到良好控制，治疗效果最佳。结果见图1。3.5吉采用明目方空白对照组大鼠视网膜血管分布均匀，排列规则，管径粗细一致，分支自然流畅；模型对照组大鼠视网膜血管迂曲走向不规则，排列紊乱，管径大小不一，可见炎性细胞灶性浸润，周围伴有均质的渗出物；与模型对照组比较，羟苯磺酸钙胶囊组及吉堪明目方各给药组均无炎性细胞灶性浸润出现。吉堪明目方中、低剂量组大鼠视网膜血管排列紊乱、管径大小不一情况有所改善。羟苯磺酸钙胶囊组及吉堪明目方高剂量组血管分布较均匀，排列较规则，管径大小较接近于空白对照组，对DR大鼠视网膜血管形态的改善作用最好。结果见图2。3.6吉堪明目方对dr大鼠视网膜vegf、内生地基因的影响与空白对照组相比，模型对照组大鼠视网膜组织VEGF、HIF-1α表达明显增加(P<0.01)。与模型对照组比较，羟苯磺酸钙组及吉堪明目方高、中、低剂量组大鼠视网膜组织VEGF、HIF-1α的表达均明显减小(P<0.05或P<0.01)。结果见图3～4和表6。3.7吉坎明方对dr大鼠肠菌群结构的影响3.7.1大肠菌群的测量序列质量和多样性分析3.7.2大肠菌群的整体结构3.8dr大鼠总体疗效评价由于各个剂量的药物组对各项指标及菌群丰度的影响不一致，故采用PCA，通过降维对所有45个样本的最终14个指标间的相关性进行考察。结果见图6。由图6可见，第一主成分和第二主成分可累积反映约92%的主成分差异来源，故适合对DR大鼠总体疗效进行评价。图中1区域表示空白对照组的主成分得分分布情况，2区域表示模型对照组的主成分得分分布情况，1区域与2区域距离较远，表明造模后模型对照组大鼠总体表现与空白对照组比较存在明显差异。图中4区域表示吉堪明目方中、高剂量组的主成分得分分布情况。图中3区域表示羟苯磺酸钙胶囊组、吉堪明目方低剂量组的主成分得分分布情况，3、4区域与1区域距离较近，距离2区域较远，表明羟苯磺酸钙胶囊组及各给药组对DR大鼠的总体表现均有明显的回调作用，以吉堪明目方中剂量组、吉堪明目方高剂量组效果最佳。图中5区域表示少数离群值的主成分得分分布情况。4吉采用明目方的临床效果通过高脂饲料喂养与低剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法建立的SD大鼠2型糖尿病(T2DM)模型，其病理生理变化更接近于人类T2DM模型，是一种成熟稳定的建模方法临床研究表明，与健康人群相比，T2DM患者肠道菌群多样性明显降低，菌群结构失衡SOD是机体内维护血管内皮细胞与血管功能的关键酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用VEGF与ANGⅡ是在DR毛细血管增生机制中起关键作用的生长因子PCA技术可通过降维把多指标转化为少数几个综合指标，从而实现对不同量纲单位、数量级数据的可比性，来综合分析试验数据和结果。本试验运用PCA技术对肠道菌群、氧化应激、血管异常新生3个方面试验结果分析后发现，各给药组对DR大鼠的总体表现均有明显的回调作用，以吉堪明目方中、高剂量组效果最佳。结果表明，吉堪明目方可从多个方面改善DR大鼠的总体状态，从而对糖尿病的发展过程产生积极影响，进而改善DR大鼠视网膜病变程度。综上所述，藏药吉堪明目方可能成为一个具有潜力的治疗“京尼萨库”病(糖尿病)的候选药物，其在治疗糖尿病视网膜病变等眼部疾病方面有良好的效果，这与藏医药经典理论记载相一致，但相关机制仍需进行进一步的研究。给药结束后，大鼠腹主动脉取血，静置，3500r·minOTU数量可以表示大鼠肠道内容物中微生物的丰度，数值越大表明微生物越丰富在属的水平上，各组大鼠肠道菌群相对丰度较高的为Lactobacillus。试验结果表明，模型对照组大鼠肠道的Lactobacillus、Bacteroides、Ruminococcus1相对丰度明显低于空白组(P<0.05或P<0.01)，高、中剂量吉堪明目方均可显著提高模型大鼠肠道中Lactobacillus相对丰度(P<0.05或P<0.01)。低剂量吉堪明目方的Bacteroides、Ruminoc