分子发光荧光磷光和化学发光法课件

第五章分子发光

—荧光、磷光和化学发光法分析化学（仪器分析部分）

第五章分子发光

—荧光、磷光和化学发光法分析化学（仪器分你知道下面的发光原理吗？磷火（鬼火）荧光棒萤火虫你知道下面的发光原理吗？磷火（鬼火）分子发光

molecularluminescence分子荧光分子磷光化学发光生物发光光致发光：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。化学发光：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。分子发光

molecularluminescence分子荧目录5-1荧光和磷光光谱法5-2化学发光与生物发光分析法参考文献：陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990JosephR.Lakowicz,PrincipleofFluorescenceSpectroscopy,KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork,1999netLibrary电子图书目录5-1荧光和磷光光谱法参考文献：目录5-1荧光和磷光光谱法

5-1-1基本原理

5-1-2荧光分析仪器

5-1-3荧光分析方法的特点与应用

5-1-4磷光分析法5-2化学发光与生物发光分析法目录5-1荧光和磷光光谱法5-1-1基本原理

5-1-1-1荧光和磷光的产生

5-1-1-2光谱曲线

5-1-1-3荧光的影响因素

5-1-1-4

荧光强度的定量关系5-1-1基本原理 5-1-1-1荧光和磷光的产生基态单重态S0

激发态单重态S激发态三重态T 10-8s10-4-1s

5-1-1-1荧光和磷光的产生1．单重态和三重态

基态单重态(singletstate)：自旋电子成对,只有一种自旋方向(相反)↑↓,电子自旋总和是零，光谱项的多重性是1，以S0表示;当基态电子激发到某高能级时,将有两种激发态：即受激电子自旋相反与自旋平行:↑↓h、↑↑h。自旋平行多重性为M=2x1+1=3，称为激受三重态（tripletstate）用T表示，自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用S表示；基态单重态S0激发态单重态S

激发单重态S与激发三重态T的不同点：⑷激发三重态的能量较激发单重态的能量低。⑶基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；⑵tS=10-8s,tT=10-4～1s；⑴S是抗磁分子，T是顺磁分子；激发单重态S与激发三重态T的不同点：⑷激发三重态的2．分子内的光物理过程

辐射跃迁：荧光：S1最低振动能级—S0磷光：S——T非辐射跃迁：(热的形式)振动弛豫内转移外转移系间窜跃系间窜跃内转移荧光的寿命比磷光的寿命短，但是量子产率较高。2．分子内的光物理过程辐射跃迁：系间窜跃内转移荧光的寿命比非辐射能量传递过程

振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。

内转换：相同多重态电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。

外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式辐射能量传递过程

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态，多为S1→S0跃迁，发射波长为

‘2的荧光；10-7～10-9s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；

‘2>

2>

1；

磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态，T1→S0跃迁；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1

发光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持续一段时间。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能5-1-1-2光谱曲线激发光谱 发射光谱 磷光光谱（phosphorescence）特征：（1）Stokes位移（2）激发波长一般不影响发射光谱的形状（3）吸收光谱与发射光谱的镜像关系5-1-1-2光谱曲线激发光谱 激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

‘2)。c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的5-1-1-3荧光的影响因素1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。 量子产率:

荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，

F接近于1，在通常情况下，

F总是小于1的）5-1-1-3荧光的影响因素2．荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；*→跃迁是产生荧光的主要类型.（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移易于实现*→跃迁的芳香族化合物容易发出荧光,而脂肪族和脂环族化合物(除少数高度共轭体系化合物以外)极少能发生荧光.2．荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型：*→的荧光（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。

金属螯合物的荧光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构增大，常会发出荧光。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互金属（4）取代基效应：芳环上有给电子基团，使荧光增强。—OH、—CN、—NR2、—OR、—NH2芳环上有吸电子基团，使荧光减弱甚至猝灭。—C—O、—NO2、—NO、—COOH、卤素离子苯酚、苯、硝基苯、苯甲酸中，产生荧光最强的是__________。（4）取代基效应：—OH、—CN、—NR2、—3．溶剂效应

同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。4．温度的影响

一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光效率为100%。3．溶剂效应分子碰撞能量转移O2的作用内滤效应自熄灭、自吸收

5．荧光熄灭（猝灭）

Fluorescencespectra(

-)ofTPPandabsorptionspectra(---)ofETH5294inplasticizedPVCmembrane:a.ExcitationspectrumofTPP;b.EmissionspectrumofTPP;c.UnprotonatedETH5294;d.ProtonatedETH5294.

荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。分子碰撞5．荧光熄灭（猝灭）Fluorescencesp5-1-1-4荧光强度的定量关系

k与仪器有关的常数I0激发光的强度

F荧光量子产率

荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数l光程长度。

根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c之间的关系是：

当

cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为：

F=Kc5-1-1-4荧光强度的定量关系k与仪器有关的常数5-1-2-1荧光分析仪器框图光源激发光单色器样品池发射光单色器(荧光单色器)检测器信号处理显示I0FIt消除溶液中可能共存的其它光线的干扰,以获得所需要的荧光.5-1-2荧光分析仪器5-1-2-1荧光分析仪器框图光源激发光单色器样品池发射4-2-1紫外-可见分光光度计的基本组成光源单色器样品室检测器显示

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。4-2-1紫外-可见分光光度计的基本组成光源单色器样品室5-1-2-2荧光分光光度计部件1．光源：氙灯激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2．单色器：滤光片、光栅激发单色器和发射单色器3．检测器

PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice

4．信号处理5-1-2-2荧光分光光度计部件灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1ug/cm-3

相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)选择性高重现性好取样量少仪器不复杂5-1-3荧光分析方法的特点及应用

1．特点

灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；2．应用

检测：金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究疾病诊断定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。2．应用检测：金属离子、有机物、生物分子定性分析：依据不同分子发光荧光磷光和化学发光法ppt课件分子发光荧光磷光和化学发光法ppt课件 1．如何获得较强的磷光增加试样的刚性固体磷光法分子缔合物的形成重原子效应敏化磷光5-1-4磷光分析法

分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射驰豫转入第一激发三重态的最低振动能级，然后跃回基态的各个振动能级，并产生辐射。这种发光现象称为磷光。 1．如何获得较强的磷光增加试样的刚性5-1-4磷光分析目录5-1荧光和磷光光谱法5-2化学与生物发光分析法

5-2-1基本原理

5-2-2化学与生物发光分析的应用目录5-1荧光和磷光光谱法5-2-1基本原理1.化学发光反应（chemiluminescence）在化学反应过程中，某些化合物吸收了反应时产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B→C*+DC*→C+h

（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学反应必须能够提供足够的能量，以引起电子激发。化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

E=150～400kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；

化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（bioluminescence）。5-2-1基本原理1.化学发光反应（chemilumi2.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt

分析物参加反应的速率；2.化学发光效率化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(3.化学发光强度与化学发光分析的依据

在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；

K为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：3.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中4.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量）

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/mL；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h

最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/mL；4.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/mL；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/mL；

氧原子与NO的发光反应：O3→O2+O（100c.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/mL～1g/mL；c.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反（2）液相中的化学发光反应应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：最大发射波长：425nm

可检测低至10-9mol/L的H2O2；（2）液相中的化学发光反应应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨

鲁米诺-H2O2发光反应速度慢，某些痕量金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+

、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O

葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶鲁米诺-H2O2发光反应速度慢，某些痕量金属离子可催化反（3）生物发光：

生物分子的检测（ATP、NADH） 萤火虫、细菌（3）生物发光：ATP的测定

在pH7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺苷(ATP)反应，生成磷酸腺苷(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：

ATP+LH2+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：

AMP·LH2·E+O2[氧化荧光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化荧光素]*氧化荧光素+h

最大发射波长562nm；可测定10L试样中10-14g的ATP，线性范围达6个数量级。ATP的测定在pH7～8；荧光素酶(E)5.装置与技术

装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录

发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：

静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；

流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；5.装置与技术装置流程：发光反应室光检测器信6.特点

灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量仪器设备简单

不需要光源、单色器和背景校正；发射光强度测量无干扰