PCR操作步骤及结果课件

PCR操作步骤PCR操作步骤1主要内容PCR主要成分PCR操作步骤PCR注意事项PCR操作常见问题讨论主要内容PCR主要成分2PCR主要成分BufferMg2+dNTPsPrimerProbeTaqDNA聚合酶模板PCR主要成分Buffer3BufferPCR的反应buffer一般为10Xbuffer主要作用是提供反应的缓冲体系，维持反应的稳定，给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。组成

Tris-HCl（pH8.3）100mMKCl500mM有利于引物与模板的退火终浓度为1XBufferPCR的反应buffer一般为10Xbuffer4Mg2+MgCl2（25mM）作用TaqDNA聚合酶活性所必需的，提供离子浓度通常Mg2+浓度范围为1-5mM。Mg2+可促进Taq酶活性影响反应产量，但浓度过高会增加非特异性扩增。对于一种未经实践的PCR反应，可以用0.5mM的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。终浓度为2.5mMMg2+MgCl2（25mM）5dNTP4种脱氧三磷酸核苷酸（25mM）

dNTP原液可稀释至25mM并分装，-20℃贮存。终浓度为0.3mM

dNTP4种脱氧三磷酸核苷酸（25mM）

dNTP原液可稀释6PrimerPCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，一般PCR反应中的引物终浓度为0.1-0.5µM。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。终浓度为0.3µM注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解PrimerPCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，一7Probe扩增产物片段中间的一段寡核苷酸片段。

该探针的5’端标记了一个荧光报告基团FAM（6-carboxyfluorescein，6-羧基荧光素），3’端标记了一条荧光淬灭基团TAMRA（6-carboxy-tetramethyl-damine，6-羧基四甲基若丹明）终浓度为0.2µM注意：稀释引物最好使用pH8.0TE，可以减弱引物的降解Probe扩增产物片段中间的一段寡核苷酸片段。

该探针的5’8TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为72℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。终浓度为1.5U注意：为保证酶的活性少受影响，应尽量保持-20℃环境TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为79PCR反应步骤反应体系配制反应条件设定上机运行，实时监测结果判读PCR产物验证PCR反应步骤反应体系配制10反应体系小心在冰上加入下列溶液于PCR反应管中（30µl

反应体系）：10×buffer(Mg2+free)3µl MgCl2（25mM）3µl dNTP（25mM） 0.36µl 上游引物（10µM） 1µl 下游引物（10µM） 1µl探针 （10µM）0.6µlTaq酶（5u/µl） 0.3µl ddH2O 18.74µlcDNA2µl反应体系小心在冰上加入下列溶液于PCR反应管中（30µl11加样顺序加样顺序12扩增条件Stage1:94℃2minStage2:

step1:94℃20sec

step2:55℃（可变）20sec

step3:60℃20sec

for45cycles荧光检测设定在stage2-step3扩增条件Stage1:94℃2min13复性温度TM-2~5℃Tm=（G+C）×4+（A+T）×2复性温度14结果判读结果判读15产物检测将反应产物取3-8µl作2.0％琼脂糖凝胶电泳，定性检测目的基因的扩增水平

产物检测将反应产物取3-8µl作2.0％琼脂糖凝胶电泳，定性16PCR注意事项无菌操作加样准确，快速（避免二聚体及非特异扩增的形成）避免污染（如cDNA污染，气溶胶污染，唾液污染等）PCR注意事项无菌操作17常见问题一、无Ct值（信号）出现：

1.反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；

2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqman方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；

3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；

5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；

6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生常见问题一、无Ct值（信号）出现：18二、Ct值出现过晚：

1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；

2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够

3.扩增产物片段过长：一般采用100－200bp的扩增长度。二、Ct值出现过晚：19三、溶解曲线不止一个主峰

1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；

2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；

3.退火温度低：提高退火温度；

4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；

5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。三、溶解曲线不止一个主峰20四、重复性不好

1.加样不准确；

2.仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；

3.模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数四、重复性不好21五、扩增