牡蛎酶解物对慢性酒精性肝损伤小鼠的保肝作用机制

牡蛎酶解物对慢性酒精性肝损伤小鼠的保肝作用机制

牡蛎是一种常见的海上无脊椎动物，在福建、广东、广东、海南、山东等沿海地区广泛分布。牡蛎在中国传统医药学中有着重要的地位，据文献报道，牡蛎具有滋阴潜阳、镇静敛汗、固精止带、化痰软坚的功效，与其它中草药搭配熬制服用，可以治疗眩晕、自汗、盗汗等疾病，且效果显著肝脏在人体的新陈代谢中起着重要的作用。肝脏疾病主要是由病毒、过度饮酒和化学物质等引起的。反复损伤性炎症可导致肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至能使机体因肝衰竭而死亡本研究通过构建慢性酒精性肝损伤小鼠模型，通过不同剂量水平的牡蛎酶解物干预慢性ALD小鼠，探究牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠的血液和肝脏生化指标的影响，并分析肝脏组织形态、关键基因mRNA转录水平上的变化以及基于16SrRNA高通量测序技术研究牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠肠道菌群的影响，来探究其保肝作用机制，以期为海洋生物资源的深加工及营养功能性食品的开发提供理论依据。1材料和方法1.1pcr和pcr扩增清洁级（SPF）雄性KM小鼠福州吴氏实验动物中心；牡蛎（Oyster）福州市金山大润发超市；中性蛋白酶Promega公司；RNAisoPlus、PrimeScriptTMRTreagentKit、gDNAEraser、SYBRPremixExTaqTMII宝生物工程有限公司；Phusion®High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer、GeneJET胶回收试剂盒、IonPlusFragmentLibraryKit48rxns建库试剂盒美国Sigma公司；谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、总胆汁酸（TBA）试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒南京建成生物工程研究所。1.2酶标仪、荧光定量pcr法电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司；酶标仪、荧光定量PCR仪美国Thermo公司；光学显微镜卡尔·蔡司股份公司；PCR仪上海智岩科学仪器有限公司。1.3方法1.3.1牡蛎50%乙醇提取物和牡蛎65%乙醇提取物的制备将牡蛎洗净磨成肉糜状，分别用95%乙醇、55%乙醇和水提取得到滤液Ⅰ、滤液Ⅱ和滤液Ⅲ，经浓缩和冷冻干燥，分别得牡蛎95%乙醇提取物（OY95）、牡蛎55%乙醇提取物（OY55）和牡蛎水提取物（OYWE）。取水提剩余物残渣，加入十倍体积的去离子水，用1400U/g中性蛋白酶酶解（pH7，时间4h）得到滤液Ⅳ，经浓缩和冻干后得牡蛎酶解物（OYEH）。1.3.2lc-ms分析称取1mg牡蛎酶解物，溶于1mLLCMSbuffer，将牡蛎酶解物溶液样品转移至对应的10kD的超滤管中，于4℃离心（12000×一维色谱分离的样品经离心干燥后，重新溶解于Nano-LC流动相（A：0.1%甲酸，B:2%乙腈/水）中装瓶上样，进行LC-MS分析。溶解后的样品以3μL体积上样到nanoViperC18预柱上（3μm，100Å），然后保持流速冲洗脱盐5min，液相为EasynLC1000纳升液相系统，样品脱盐后再经分析柱分离，分析柱规格是C18反相色谱柱。采用PEAKSStudio8.5（version8.5,BioinformaticsSolutionsInc.Waterloo,Canada）软件进行数据加工处理和检索分析。1.3.3小鼠牡蛎酶解物灌胃实验小鼠经过1周适应性喂养期后，将其随机分为以下四组，每组10只：正常组、模型组、牡蛎酶解物低剂量组（OYEL组）、牡蛎酶解物高剂量组（OYEH组）。连续灌胃给予牡蛎酶解物4周，每天上午9时给予各组小鼠灌胃，牡蛎酶解物实验组中的小鼠分别灌胃0.25mL高、低剂量牡蛎酶解物（溶于无菌蒸馏水中），高、低剂量分别为80mg/kg·day、40mg/kg·day，正常组、模型组给予等体积0.9%的生理盐水。下午4时给予正常组0.9%生理盐水，剂量为5mL/kg，给予模型组、OYEL、OYEH组小鼠50%乙醇灌胃，剂量为5mL/kg。末次灌胃后，各组小鼠隔夜禁食16小时后眼眶取血，颈椎脱臼处死小鼠。1.3.4小鼠肝组织中hyp的计算取小鼠肝脏称重，肝脏指数按公式（小鼠肝脏指数=肝脏湿重/体重×100％）计算。用离心管收集小鼠血液，室温静置1h后3000×将9倍体积的生理盐水加入肝组织中，并将肝组织在冰水浴中匀浆。将制备的匀浆在4℃下以2500×1.3.5肝组织形态分析取肝组织迅速置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋。经常规脱蜡、脱水后做H＆E染色，通过40×显微镜放大拍照观察肝组织形态。1.3.6mrna的转录水平从肝组织中提取总RNA，并逆转录成cDNA。采用RT-qPCR测定TLR4、NF-κB、TNF-α的mRNA的转录水平。小鼠基因引物序列如表1所示。聚合酶链式反应条件为95℃进行30s，并进行40个循环的95℃25s和60℃30s。通过Rotor-geneQ软件进行数据分析，通过21.3.716srna基因的高流量测量序列1.3.7.1.样品预处理分别取正常组、模型组、OYEL组、OYEH组各六只小鼠的盲肠肠道内容物2g，加入磷酸盐缓冲溶液，反复清洗离心，取沉淀物。1.3.7.2.提取氨基酸化合物dna使用CTAB法对各组的DNA进行提取，引物对应区域为16SV3-V4区。1.3.7.3-牡蛎酶解剂对大鼠肠道菌群的影响基于R语言，绘制影响酒精性肝损伤的生化指标与属水平上的肠道菌群的关联热图，使用cytoscape3.6.1软件绘制相关性网络图。1.3.8数据处理与统计分析使用DPS6.50数据处理系统和Excel对数据进行统计分析。使用单因素方差分析（ANOVA）统计差异显著性，以2结果与分析2.1牡蛎提取物的干重得率图1表示了牡蛎4种提取物的干重得率，从图中可以看出，牡蛎提取物的干重得率依次为：OY95（28.06%）>OYEH（21.72%）>OYWE（19.00%）>OY55（8.95%）。牡蛎提取物的总得率为77.73%。2.2oynh的多肽序列及丰度表2列出了牡蛎酶解物中主要多肽的序列。由表2可知，从0到30分钟的不同保留时间中，OYEH主要有20个多肽序列。肽的丰度从高到低（前5）依次为：GHPGLPGDAGPEGPRGNPG、IDLGAVN、EHPVL、GPAGPIGPR、MFLGPQ。另外，图2显示了丰度为前5的肽的一级质谱图和二级质谱图。2.3小鼠体重、状态及死亡数量的测定图3为小鼠第1~4周体重变化柱状图。从图中可以看出，在饲养第一周，各组间小鼠体重差异不显著，2~4周正常组的体重高于其他组，在第二周后，OYEH组的体重高于OYEL组与模型组。通过4周的动物实验，观察并记录了小鼠的外观、行为及死亡数量。正常组毛发光亮紧凑，行动灵活自如。模型组毛发暗淡无光，杂乱无章，且精神状态涣散，给予酒精后有嗜睡现象。OYEL与OYEH组的情况较模型组有所改善。2.4大鼠血清生化指标分析如图4A、B所示，OYEH组的ALT、AST水平都显著低于模型组（2.5肝组织形态分析从图5A可以看出，模型组的肝脏指数极显著高于正常组（小鼠肝脏组织的病理学切片如图6所示。从图6a可以看出，正常组的肝细胞较完整，无细胞破裂、自溶或坏死的现象，分布均匀，肝细胞呈规则的球状。在图6b中，在肝小叶周围的细胞消融严重，且肝小叶中有溶血的情况，细胞分裂严重。细胞形状不规则，出现皱缩，大小出现差别。肝细胞之间的边缘模糊，有一定的脂肪空泡。由图6c和图6d可以看出，OYEL与OYEH干预后，相对于模型组，细胞的溶血情况有一定的改善，其中OYEH组呈现出最接近正常组的状态。2.6mtna转录水平牡蛎酶解物对慢性ALD小鼠肝脏中TLR4、NF-κB和TNF-α基因在mRNA转录水平上的影响如图7所示。在图7中，与正常组相比，模型组小鼠肝脏TLR4、NF-κB和TNF-α基因mRNA的转录水平都显著升高（2.7大鼠肠道菌群多样性与生化指标之间的相关性分析2.7.1各门地位类分析用OYEH饮食干预小鼠4周后，测定正常组、模型组、OYEL组和OYEH组小鼠肠道菌群的相对丰度，结果显示，各组在门水平上的主要优势门类为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其余菌门相对丰度较低（图8）。与正常组相比，模型组的厚壁菌门相对丰度显著降低（选择属水平上丰度前3的物种，图9可知，在属水平上的优势菌属主要有2.7.2小鼠肠道菌群与慢性酒精性肝损伤生化指标的关联性分析在属水平上选择丰度在前30的物种，基于Spearman相关检验r指数分析，研究属水平下小鼠肠道菌群与影响慢性酒精性肝损伤参数之间的统计学相关性，如图10所示，在各组中富集的3酒精性肝损伤小鼠肠道菌群的变化牡蛎中含有丰富的生物活性物质，以牡蛎为原料，对其中活性成分依次进行提取和制备，通过动物实验研究牡蛎酶解物对慢性酒精性肝损伤的保护作用，并结合肠道菌群分析其保肝的作用机制。肝脏是酒精代谢的主要器官，机体摄入的酒精过多会导致不同程度的肝损伤。ALD的发病机制与乙醇及其代谢物对肝脏的毒性