玉米赤霉烯酮的生物脱毒研究进展

玉米赤霉烯酮的生物脱毒研究进展

玉米又名红二醇，也被称为f-2毒素。这是刀菌产生的次代谢产物，stob等。目前，玉米赤霉烯酮的脱毒技术已引起了人们的高度重视，主要是利用物理、化学和生物脱毒法在本研究前期，发现盐碱土壤中存在着丰富的酚类化合物降解菌1材料和方法1.1实验菌株菌株WLB-29分离自盐角草根际土壤1.2细胞、培养基和仪器玉米赤霉烯酮(标准品)，上海源叶生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，赛默飞世尔(Fisher)科技中国有限公司；Genview细菌基因组DNA提取试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；LB培养基、TSB培养基、R2A培养基和NB培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；M培养基(海生菌肉汤2216)，上海创赛科技有限公司。超声波细胞破碎仪，Branson公司；高效液相色谱仪(HPLC),Agilent公司。无机盐培养基(g/L):Na1.3单一碳源利用及耐盐特性分析分别接种菌株至含有10mg/LZEN的无机盐培养基平板和LB培养基斜面上，30°C恒温培养3d，置于4°C保存，备用。菌体镜检染色采用结晶紫染色法。菌株单一碳源利用分析采用BiologGenII鉴定板，挑取少量新鲜培养的菌体制备菌悬液，接种到BiologGenII鉴定板，于28°C恒温培养48h，利用Biolog自动微生物鉴定系统读取数据，分析其单一碳源利用情况。菌株的生长温度耐受(10、45°C)测定采用LB培养基平板进行；菌株耐盐特性的测定采用含有不同浓度NaCl(2%、5%、10%)的LB培养基平板进行；菌株耐ZEN特性的测定采用含有不同浓度ZEN(10、20、40、60mg/L)的无机盐培养基平板进行。1.4pcr扩增实验挑取少量新鲜菌体作为PCR扩增模板，采用细菌16SrRNA基因序列PCR通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCCGCA-3′)，扩增实验菌株目的片段。PCR反应体系(50μL):2×Mix25μL，正、反向引物(10μmol/L)各1μL,ddH所得序列经人工校对后，分别上传至EzTaxon数据库和GenBank数据库进行BLAST比对，调取相近的模式菌株序列。序列相似性分析和NJ系统发育树(BootstrapValue=1000)构建采用MEGA7.0软件，以初步明确实验菌株WLB-29的分类地位1.5样品溶液的配制采用Agilent1260高效液相色谱仪对ZEN含量进行测定，色谱柱为安捷伦ZORBAXEclipseXDB-C18柱(4.6mm×150mm，粒径5mm)；流动相为乙腈:水:甲醇=46:46:8(体积比)；流速为0.8mL/min；进样量为10μL；柱温为30°C；检测波长为254nm。分别配制浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20.0mg/L的ZEN标准溶液。在上述色谱条件下，依次从低浓度到高浓度进样，记录各样品ZEN峰面积A(mAU·S)，并与对应标准溶液浓度c(mg/L)绘制ZEN标准曲线。1.6有机滤膜的制备取1mL发酵液，加入等体积的甲醇充分混匀，使用超声波处理10min(功率20kHz，工作时间3s，间歇时间3s)，然后8000r/min离心5min，吸取上清液，并利用有机滤膜(0.22μm)过滤，所得溶液上机检测1.7菌株降解zen的影响因素实验初始条件为取菌种活化后的种子液1mL，接种到100mL的LB液体培养基中，30°C、120r/min振荡培养120h后，取样检测菌液OD在此基础上，通过单因素优化，考察不同培养基(LB、NB、MA、R2A、TSB)、不同温度(20、25、30、37、42°C)、不同初始pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、不同菌液接种量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)和不同ZEN浓度(2、4、6、8、10mg/L)对菌株降解ZEN能力的影响，每个条件设置3个重复，并进行条件优化1.8蘑菇价格降低在各条件因素优化的基础上进行菌种发酵培养，培养试验设置3个重复，每24h取一次培养液，测定OD2结果与分析2.1菌株的生长和nj系统发育树菌株WLB-29分离自乌拉泊盐湖周边植物盐角草根际土壤，相关样品接入以10mg/LZEN为唯一碳源的无机盐培养基，于30°C、120r/min条件下振荡富集培养4d后，富集液经梯度稀释、涂布，待菌落长出后，根据菌落在ZEN为唯一碳源培养基中的生长速度、形态、大小及颜色初筛，再通过检测降解效率进行复筛而获得试验菌株通过培养发现，菌株WLB-29为革兰氏阴性、球状细菌，可在LB、TSB等营养丰富的培养基上良好生长，也可以在R2A、MA及以ZEN为单一碳源的无机盐培养基等贫营养培养基上良好生长。通过Biolog碳源实验表明，菌株可以利用的碳源物质主要有D-果糖、柠檬酸、D-甘露醇、α-酮戊二酸和L-谷氨酸等。在以ZEN为单一碳源的无机盐培养基上，菌株可在10-40mg/LZEN条件下良好生长，可耐10%的NaCl，生长温度范围在10-45°C。采用LB培养基于30°C培养2d，其菌落形态呈圆形，较小(直径约为1mm)，乳白色，表面湿润、有光泽，半透明，边缘比较平整(图1)。通过对菌株WLB-29的16SrRNA基因序列进行扩增和测序，上传其16SrRNA基因序列至GenBank(登录号为MT196321)，并构建了其NJ系统发育树(图2)。结果表明，菌株WLB-29归属于斯塔普氏属(Stappia)，与其相似性最高的模式菌株为印度洋斯塔普氏菌(StappiaindicaB1062.2色谱结果分析HPLC检测ZEN标准品的色谱图如图3所示，在实验采用的色谱条件下，ZEN标准品的保留时间为8.726min，色谱波峰完整，对称性良好，分辨率较好。不同浓度的ZEN出峰时间稳定，即使在最低浓度0.5mg/L时，波峰仍较为完整，可有效检出。根据峰面积和ZEN浓度关系绘制其标准曲线(图4)，计算得到回归方程为Y=19.010X-3.115,R2.3培养条件对蘑菇分解的影响2.3.1b-29的生长和降解率使用不同培养基分析培养基对菌株WLB-29的生长和降解率的影响，结果如图5所示。由图5可知，菌株在LB液体培养基上生长最好，最大生长OD2.3.2接种量对菌株降解zen的影响在发酵过程中，采用较大的接种量可以缩短发酵时间，使产物的形成提前到来，实验分析了接种量对菌株WLB-29生长和ZEN降解率的影响。由图6可见，在实验中菌液OD2.3.3en降解情况实验使用菌株生长较为明显的多个温度，对菌株WLB-29生长和ZEN降解情况进行了分析。由图7可知，菌株在实验所用的温度范围中均能较好地生长，最适生长温度范围在30-42°C。在ZEN降解情况方面，在20-37°C内，菌株对ZEN降解率随着菌株生长OD2.3.4培养阶段的ph值对植物分解的影响培养基初始pH值对菌株WLB-29生长和ZEN的降解率的影响见图8。在实验中菌株的OD2.3.5培养培养基中zen浓度如图9所示，菌株WLB-29的生长和ZEN的降解率受ZEN浓度的直接影响，其中，当培养基中ZEN浓度增大时，发酵液中微生物细胞浓度呈下降趋势，这可能与ZEN对菌株WLB-29细胞有毒副作用有关。同时，ZEN的降解率受培养基中ZEN浓度加大的影响非常明显，当培养基中ZEN浓度低于6mg/L时菌株降解效率较低；当大于8mg/L时其降解效率明显提高，但继续增加培养基中ZEN浓度时降解率增加不明显。2.4菌株对zen的降解规律采用优化后条件，即：使用ZEN终浓度为10mg/L的LB液体培养基，菌液接种量为2%，初始pH为8.0，发酵温度37°C，定期检测菌液浓度和培养基中ZEN的含量，并计算其降解率，绘制菌株的生长曲线和ZEN降解曲线。如图10所示，菌株接种8h后进入对数期，发酵48h后逐渐进入稳定期；菌株WLB-29对ZEN的降解伴随着整个菌株的生长过程，而且与发酵时间呈线性关系，降解过程在菌株进入稳定期后仍可对ZEN进行有效降解，培养至144h时降解率最高可达到92.56%。同时，分别对实验中菌株生长12h和144h的发酵液进行HPLC检测，色谱图见图11。由图11可见，与菌株生长12h后的发酵液相比，144h的发酵液中ZEN几乎完全降解，但其在HPLC检测1.0、3.0、4.0、7.3、7.7min中相关产物峰值明显增加。由于本次HPLC采用的紫外光检测器(波长：254nm)其着色基团主要为苯环，因此初步可以推断，菌株对ZEN降解主要发生在其内酯环，并形成了多种苯类化合物，但相关化合物具体结构有待进一步验证。3玉米赤霉烯酮菌株的降解菌株耐盐菌可降解多种难降解有机化合物，特别是在化工有机污水处理中有着明显的优势，国内外也在各类盐环境中分离出大量多酚类化合物降解菌通过对该菌株降解ZEN条件优化，在培养基中加入ZEN，该菌降解最佳条件为：LB培养基、37°C培养、pH8.0、2%接种量和ZEN初始浓度为10mg/L，培养144h后，ZEN的降解率最高可