备课素材：叶盘法的原理及影响因素- 高二下学期生物人教版选择性必修3

叶盘法的原理及影响因素先看一道试题：科学家利用叶盘法将葡萄的相关基因导入番茄，得到早熟番茄。叶盘法的具体做法是：先将实验材料的叶子表面进行消毒，再用消毒过的打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。将它放在土壤农杆菌培养液中浸泡4～5min，然后用滤纸吸干，放在特殊培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上继续培养。数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化成幼苗。请回答：（1）科学家培养早熟番茄应用了基因工程技术，该技术的原理是

，科学家利用叶盘法时属于基因工程的第三步，即

。（2）农杆菌通常感染

植物和裸子植物，是因为这些植物在伤口处的细胞会分泌大量的

化合物，吸引农杆菌。农杆菌能够介导转化的原因是：

。（3）愈伤组织经后续处理可以得到早熟番茄幼苗，这是因为愈伤组织细胞中含有

和

。答案：（1）基因重组

将目的基因导入受体细胞（2）双子叶

酚类

含有的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上（3）番茄全套的遗传物质

葡萄相关基因解析：（1）基因工程技术的原理是基因重组。叶盘法是将葡萄的相关基因导入番茄，是基因工程的第三步，即将目的因导入受体细胞。（2）农杆菌通常感染双子叶植物和裸子植物，是因为这些植物在伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌。农杆菌能够介导转化的原因是含有的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。（3）愈伤组织经后续处理可以得到早熟番茄幼笛，这是因为愈伤组织细胞中含有番茄全套的遗传物质和葡萄相关基因。植物细胞利用农杆菌Ti质粒转化常用的方法称为叶盘法。叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。那么，其原理是什么？影响因素有哪些？叶盘法的步骤：先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。在超净工作台上，为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4－5min，然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养，注意需将叶子背面接触培养基。所谓看护培养基，是特定的固体培养基上均匀分布一层胡萝卜细胞或其他细胞的悬浮液，然后覆盖一层滤纸即成。叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养。将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。在光照的条件下，25℃进行选择培养。选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽，或者产生抗性愈伤组织。将这些抗性材料转移到相应继代选择培养基上，或者转入附加选择压的生长和分化培养基中，令其生长和诱导分化。待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行根培养，两周左右长出不定根。最后分化出幼苗。对这些幼苗的进一步检测(如用Southern印迹法、Northern印迹法、免疫分析法等)可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。叶盘法的机理：叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动T-DNA向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株（如图）。叶盘法的优点和影响因素：叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。影响遗传转化因素也有很多，如植物基因型，农杆菌类型，外源基因的选择、预培养和共培养时间等。例、叶盘转化法是Horsch等人于1985年发展起来的一种转化法，以培育转基因耐盐毛白杨为例，操作程序是先将毛白杨叶子表面进行消毒，再用消毒过的打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。然后进行下列操作，请回答:（1）毛白杨叶盘与重组农杆菌共培养以进行遗传转化：农杆菌能够介导转化的原因是

。（2）脱分化和筛选培养：叶盘接种在含卡那霉素的培养基上,卡那霉素的作用是

，作为运载体的Ti质粒应含有

基因，运载体上的

是RNA聚合酶识别和结合的位点。（3）获得抗性植株：叶盘周围长出愈伤组织后分别转移到诱导“生芽”和“生根”的培养基中，此过程培养基中加入的植物激素主要是

。（4）耐盐基因的检测与鉴定:①分子水平：可采用

的方法来检测转基因毛白杨提取液中有无相应的耐盐蛋白。②个体水平:请设计个体水平检测方案

。答案:（1）含有的Ti质粒上的T-DNA可转