利用纳米技术快速检测食源性致病菌的研究

快速检测食源性致病菌的研究上海市延安中学黄逸男(个人项目)二零一零年一月是九十年代四大食源性致病菌中重要的两种食源性致病菌。食用了被污染的本课题采用先进的IMS/PCR方法，利用抗李斯特菌免疫磁性分离技术素(stx1)和Ⅱ型志贺毒素(stx2)、eaeA基因(粘附因子)和hlyA基因(溶血师及上海市疾病预防控制中心的许学斌老师的帮助下，利用课余及假期时间独立完成的，在此我对曾经帮助辅导过我的老师表示衷心的感谢。本课题分以下几个阶段完成：1.查阅并完成有关方法资料的收集整理，设计实验方案。2.查阅文献并设计特异性引物；3.确定复合PCR反应体系的条件；4.进行标准菌株的验证工作，包括标准菌株及革兰氏阳性和革兰氏阴性标准菌牛肉、蔬菜和生的冷冻点心等，分别用传统标准方法、IMS/PCR方法作平行实验，阳性结果通过API方法确证，获得检验结果，并统计传统方法与本方6.科研工作总结，论文撰写，成果查新。查新结论：该项目的研究具有国内外新颖性。五、推广应用及社会经济效益分析本方法采用纳米技术，运用IMS/PCR联用方法最大程度的提高该致病菌的检出率和灵敏度，其灵敏度达到5CFU/mL。最大优点是少量、快速、经济。在5小时能够检出LMO和大肠杆菌0157。克服常规方法耗时长、繁琐及不够精确的缺点。此方法建立后，可与经典常规方法互补，在分子生物学水平上对单增李斯特菌和大肠杆菌O157等食源性致病菌进行检测，预计将在食品安全的快速检测部门、食品工业部门及卫生监控部门具有较广的应用前景，同时对2010年世博会的食品安全检测技术将起到积极的作用。有一定的经济和社会效益。1.实验菌株本实验所用标准菌株共16株。菌种均来自辅导实验室菌种库的菌株。表1本实验所用菌种..ATCC35967ATCC35897大肠杆菌0157:H7ATCC51816ATCC49214E.coli01574-92*2.主要生化试剂AntiListeriaantibodycoatedbeadsnmmLDynalOsloNor晶美生物工程制品有限公司(代理商)。Antiantibodycoatedbeads北京安普生物有限公司(代理商)。上海生工生物工程技术服务有限公司合2.4吐温-20:上海化学试剂公司。2.5葡萄糖：上海化学试剂采购供应站分装厂。2.7氯化钠：上海化学试剂有限公司。2.9李斯特菌选择性牛津平板:Merck,Germany。2.11科玛嘉0157显色培养基(CHRMagar):郑州博赛生物工程有限责任2.15Taq聚合酶：宝生物工程(大连)有限公司。2.16PCR缓冲液(Mg²+):宝生物工程(大连)有限公司。2.17dNTP混合液：宝生物工程(大连)有限公司。2.18DL2000DNA分子量标记：宝生物工程(大连)有限公司。2.19EDTA:上海化学试剂有限公司。2.20琼脂糖：上海华舜生物工程有限公司。UNIQ-10柱式基因组DNA小量抽提试剂盒：上海生工生物工程制品有限公司。API(CH20)生物鉴定试剂盒：法国梅利埃生物有限公司。VIDAS试剂条：法国梅利埃生物有限公司。4.1全自动荧光酶检系统(Mini-Vidas):法国梅利埃生物有限公司。4.4高速冷冻离心机。4.5恒温摇床。4.6电泳仪：美国公司。4.7凝胶成像分析系统：美国公司。在800mL蒸馏水中溶解8gNaCl;0.2gKCl;1.44gNa₂HPOgKHPO调节pH值到7.4,加水定容至1L,在1.034×10⁵Pa灭菌20分钟。保存于室温。5.3李斯特菌选择性牛津平板加29.25g干粉至500mL蒸馏水中，于121℃,15分钟灭菌。用5mL的1:1乙醇和无菌水溶解选择性添加剂。混匀后加入50℃左右琼脂中，然后倒平5.4洗涤缓冲液原液(0.1molL):28.75gNa2HPO₄12H₂O;2.72gKH₂PO₄加入1000mLH₂O,工作洗涤缓冲液(0.01mol/L):90mL生理盐水；10mLPBS原液；1滴吐温20,现用现配。5.5出血性大肠杆菌0157增菌液(EC)新生霉素mEC培养基：在1L蒸馏水中溶解20g蛋白胨、1.12g胆盐、5.0g6.9±0.1;于121℃,15分钟高压灭菌备用，用时加入1%新生霉素溶液。EB增菌液：在1L蒸馏水中溶解17g胰酪胨、3.0g胆盐植物蛋白胨、5.0g蛋于121℃,15分钟高压灭菌备用。5.70157科玛嘉平板每2.9g干粉溶于100mL蒸馏水中，加热至100℃,不断搅拌。如果用高压灭菌器，不要加压，加热不能超过100℃,混合物液可以在微波炉内加热，煮全溶解。水浴冷却至48℃,如果需要选择性更强的培养基须加入碲酸钾溶液，培养基在室温可保存一天，或在4℃冰箱内贮存数天(避光)。菌落色彩初筛微生物紫红色大肠杆菌0157*大肠菌群无色至灰色变形杆菌等1.1严格按照无菌操作规程称取25g样品，放于225mLEB/EC肉汤中30℃/37℃培养24小时之后，(LMO)取1mL增菌液接种于10mL的李斯特菌增菌肉汤，30℃培养24小时。观察肉汤是否变黑。1.2以无菌方式吸取变黑2~3mL的李斯特菌增菌和O157增菌肉汤，在100℃水浴中加热15小时，取出500μL煮沸灭活的增菌肉汤加入LMO/0157VIDAS试剂条的样品孔内，根据VIDAS操作规程检测。若VIDAS的结果为阴性，则可判定样品为阴性；如果VIDAS的结果得出是阳性，则需要对该阳性可疑样品进行鉴定。1.3对于VIDAS阳性结果的样品，需划线分离至牛津平板/柯玛嘉显色选择平板上，37℃24小时培养，观察菌落特征。1.4.1(LMO)挑取牛津平板上小的，灰色的可疑菌落，用API作进一步鉴定。按照APIListeria鉴定卡的操作规程对典型的菌落进行接种，经过35℃~37℃,18~24小时培养，读取结果。1.4.2(0157)挑取在柯玛嘉显色平板上，呈紫红色菌落。作进一步血清列酶联反应，免疫捕获、洗涤、标记物和底物反应、荧光分析，45分钟3.21麦氏比浊100μL加至特定管中，0.5麦氏比浊50μL加至以后9个管3.335～37℃,培养18～24小时。3.4加一滴染液至特定的孔中，3分钟。4.1在25g样品中，加入1%加酶蛋白胨水50mL至样品袋中，拍打20分4.2将上层清液轻轻倒入50mL离心管中，5000rpm离心2分钟。4.3将上层清液倒入另一个50mL离心管中，5000rpm离心20分钟。4.4将上层清液倒出，加入700μLPBS/0.1%吐温20,将管壁沉淀悬浮，转移至1.5mL离心管中。4.5在离心管中加入20μL包被单增李斯特菌抗体或大肠杆菌0157的免疫beads),缓慢颠倒180°振摇10分钟。4.6将离心管放至磁性架上，静至10分钟。4.7慢慢吸去上清液。4.8加入200μLTE悬浮磁珠。4.9按5方法提取DNA。4.10PCR检测。5.1收集待测菌体，用200μLTE悬浮。5.2加入400μL消化液，混匀；加入10μL蛋白酶K(10mg/mL),混匀，55℃保温5分钟。5.3加入200μL无水乙醇，混匀，然后将样品全部转移到UNIQ-10柱。5.410,000rpm,室温离心1分钟。5.5弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μL洗液，10,000rpm,室温离心1分钟。5.6重复步骤5.5一次。5.7取下UNIQ-10柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000rpm,室温离心1分钟。5.8在柱子中央加入100μLElutionBuffer,将柱子放入新的干净1.5mL或2.0mL离心管中。5.910,000rpm,室温离心1分钟。即为基因组DNA。根据用途，-20℃保存。IMS/PCR检测方法程序如下：食品样品(25g)加入0.1%的蛋白胨水50mL拍打20分钟5000rpm,离心2分钟5000rpm,离心20分钟试剂盒抽提DNA6.1DNA抽提同5方法。引物作用对象顺序序列长度(bp)引物序列(5'--3')序列长度hlyA-RAATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT6.3.20157反应体系引物hly-RTaq酶(100U)5分钟1分钟1分钟40个循环1分钟延伸8分钟94℃7分钟最后72℃延伸5分钟。取20μLPCR产物，加2μL10x上样缓冲液点样进行电泳。PCR产物电泳检测所用的凝胶浓度为2.0%。120V,电泳1小时。7.灵敏度实验7.1待用样品(肉糜)121℃,20分钟灭菌，冷冻过夜。7.2称取7.1所得的样品25g至无菌均质袋中，每个样品各2份，另加阳性对照2小时，细菌数为5×10⁶,用无菌重蒸水做10倍递增稀释液10⁻¹-107。7.4将7.3制得的菌液分别加至7.2样品中1mL,一份样品加入225mLEB增菌液或EC增菌液中，30℃培养24小时，分别吸取10μL、100μL菌液，分别划血平板，37℃培养24小时，计数。7.5另一份样品振摇后，然后按照免疫磁珠吸附法操作，电泳结果与计数结果对照，显示其灵敏度。8.食品检验及经典方法验证肉汤中，30℃/37℃,24小时增菌，用IMS/PCR方法进行单增李斯特菌和大肠杆菌0157检验，同时用传统经典方法作平行实验，对阳性菌株作API确证。9.单增李斯特菌和大肠杆菌0157检测平行试验：拍打20分钟37℃24小时37℃24h+API20E37℃,24小时1.对引物设计的验证提取标准菌株LMOATCC7644DNA,分别加入上面设计的特异性两对引物进行PCR,结果如下。1.DL2000分子量；2.两对引物；3.阴性对照；4.阴性对照；5.一对引物引物和一对特异性引物及不用引物进行多重PCR,结果和实际符合。二对引物用标准菌株16株，其中单增李斯特菌2株，李斯特菌属5株，01575株，G*及G菌各2株。见表4。菌种名称单核细胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes属种(血清)++单核细胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes++++格氏李斯特菌Listeriagrayii+斯氏李斯特菌Listeriaseeligeri+韦尔希默氏李斯特菌Listeriawelshimeri+金黄色葡萄球菌Staphylococusaureus肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis出血性大肠杆菌E.coliO157:H₂埃希氏大肠菌EscherichiaColiE.coli0157++Ecoli0157十十E.coli0157十十从表4中可看出，复合PCR结果显示出本实验所设计的特异性引物正确，和标准菌株的结果完全符合。PCR确证如图2、图3。图2:单增李斯特菌、李斯特菌属及阴性菌株比较图3:0157不同种PCR电泳结果3.食品检验及经典方法验证结果我们对从超市及农贸市场购买的的200个样品进行IMS/PCR和经典方法的验证，结果，符合率为100%。具体列表如下：表5实际样品中单增李斯特菌和大肠杆菌O157检测结果N(样品数)IMS/PCR法阳性数API确证阳性数0000蔬菜111鸡肉0000冷冻点心777777牛肉622220000猪肉41100000000总计从上表中可看出，单增李斯特菌阳性检出率排序分别为牛肉33%、冷冻点心30.4%、猪肉25%、猪肉糜16%和新鲜蔬菜4.3%。0157未检出。同时也提醒我们在食用以上几种产品时，一定要注意加热后再食用，避免生食。4.模拟样品检测的敏感性实验数。标准菌株LMOATCC7644或O157ATCC43889,接营养菌株可检出的最低稀释度细菌接种量敏感度(CFU/mL)55对照5.阴性对照6.10'稀释度(标准菌株ATCC7644浓度)7.10²稀释度8.10³稀从上面PCR结果看到，10-5稀释度为其检测低限，其对应的菌落计数为5CFU/mL。杆菌0157菌株。的血清型，但是多克隆抗体并不能区分致病性、非致病性李斯特菌和E.coli0157,也不能区分李斯特菌属内和E.coli0157属内的各种菌。因此，单独用免0157的DNA,因此免疫磁珠吸附的与李斯特菌有交叉抗原的非LMO或大肠杆菌0157菌及其它杂菌，不会干扰PCR的结果。因此，性的检测LMO或大肠杆菌0157,敏感度高。可在5h内完成检测，且检测结果和PCR反应是在经体外扩增目的基因或特定DNA片段的一种十分有效的技术，复合PCR反应中应用的二对或多对核酸引物，其