双缩脲法测定蛋白质

试验统计试验统计是在进行科学研究过程中积累资料、经验一项主要工作，每一次试验过程中都应该养成良好习惯，及时做好统计和总结。要求：⑴真实性⑵原始性⑶完整性⑷条理性试验汇报书写试验结束后，应及时整理和总结试验结果，写出试验汇报。完整试验汇报应包含：试验题目、试验目标、试验日期、操作步骤与条件、试验结果、讨论和结论等项目。双缩脲法测定蛋白质第1页试验室规则

上试验课时不迟到，不早退，自觉恪守课堂纪律，上课时应保持试验室平静，不得大声说笑。进入试验室必须穿试验工作服。试验课前认真预习相关课程，明确试验目标、要求和注意事项，熟悉试验内容和方法步骤。试验时应恪守试验操作规程，按教师要求，认真操作。要细心观察试验现象，认真统计试验数据，作出结论，最终写出试验汇报。要爱护公物，小心使用仪器和试验设备，注意节约用水、电、药品和器材。全部固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。双缩脲法测定蛋白质第2页试验室和试验台应保持整齐。公用试剂用毕，马上盖严并还原。试验完成，仪器洗净放好。在试验过程中必须恪守操作规程，不得随意乱动荡用。如不会使用，应请教指导教师。凡因乱动荡用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按相关要求进行赔偿和处理。禁止在试验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，试验室内学生轮番安排值日，试验结束离开试验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。双缩脲法测定蛋白质第3页试剂使用规则使用试剂前应该仔细识别标签，看清名称及浓度，是否为本试验所需。取出试剂后，马上将瓶塞盖好，放回原位；未用完试剂决不可倒回原瓶。取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用洁净吸管吸收标准液，以免污染瓶中标准液体。使用滴管时，滴管尖端朝下，防止试剂流入橡皮帽内。使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸收，以免造成意外。双缩脲法测定蛋白质第4页吸量管使用正确拿法：中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端。取液：用吸耳球吸收液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。放液：吸量管移入准备接收溶液容器中，使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量管应最终靠壁15秒。双缩脲法测定蛋白质第5页吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖溶液。这类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字吸量管，则无须吹出管尖残留液体。(0.5ml以下都要吹）吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。吸收血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色吸量管，用后应及时用自来水冲洗洁净。假如吸收普通试剂吸量管可无须马上冲洗，待试验完成后，用自来水冲洗洁净，晾干备用。吸量管使用注意事项双缩脲法测定蛋白质第6页玻璃器皿普通清洗方法普通玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水重复冲洗，最终用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最终用蒸馏水淋洗2～3次，干燥备用。比色杯：用毕马上用自来水重复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。防止用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。上述全部玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为洁净标准)后，依据需要晾干或烘干。双缩脲法测定蛋白质第7页分光光度法光是一个电磁波，通惯用频率和波长来描述光。人视觉所能感觉到光称为可见光，波长范围在400～760nm，人眼睛感觉不到还有红外光（波长大于760-5000000nm）、紫外光（波长200-400nm）、X射线等。在可见光区，不一样波长光呈不一样颜色，但各种有色光之间并没有严格界限，而是由一个颜色逐步过渡到另一个颜色。溶液颜色与吸收光颜色关系普通性试验-1双缩脲法测定蛋白质第8页Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律描述物质对单色光吸收强弱与厚度和待测物浓度关系。含义：一束单色光经过溶液时，光能被吸收程度与溶液浓度和液层厚度成正比。A＝KCL或lgI0/I=KCLA为溶液对光吸光度，反应了物质对光吸收程度；C为溶液浓度；L为溶液厚度；I0为照射待测物质单色光强度，I为透过待测物质光线光强度，透光度T=I/I0即溶液透过光强度与入射光强度之比；K为吸光系数，是物质在单位浓度和单位厚度条件下对入射光吸光度。试验中溶液厚度不变，则A＝KC双缩脲法测定蛋白质第9页光吸收示意图I0IbC双缩脲法测定蛋白质第10页吸收光谱和物质定性分析物质吸收光谱与物质分子结构相关。吸收光谱曲线是物质特征曲线。用各种不一样波长光线作为入射光测定物质吸光度（Absorbance），然后以波长（λ）为横轴，对应吸光度（A）为纵轴，按结果作图，可得到该物质吸收光谱曲线，这种曲线表达了物质对不一样波长光吸收能力。在一定温度、pH值等条件下吸收光谱曲线形状是一定。在吸收光谱中，往往可找到一个或几个吸收最大值，该处波长称为最大吸收波长（λmax）。物质不一样，它们最大吸收波长也往往不一样。双缩脲法测定蛋白质第11页不一样浓度VitB12溶液对相同波长光不一样吸收µg/mlAλ＝550nm双缩脲法测定蛋白质第12页原理：依据物质对于入射光特征吸收，可应用于物质溶液定性检测比较吸收光谱曲线：在相同条件下，吸收光谱曲线不一样，表明物质化学结构不一样。比较最大吸收波长：不一样物质最大吸收波长不一样；化学结构相同物质最大吸收波长相同，吸收系数不一样。比较吸光度比值：多用于检测物质纯度（DNAA260/A280=1.8纯度判定)物质定性分析惯用方法双缩脲法测定蛋白质第13页物质定量分析标准曲线法配制一系列不一样浓度标准溶液，用选定显色剂显色。选取适当波长入射光。测定时先以空白溶液调整透光率100%，然后分别测定标准系列吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条经过原点直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。标准管法对个别样品进行测定，且A-C曲线线性良好直接比较测定结果。

A标=K标c标b标

A测=K测

c测

b测

c测=A测

/A标×c标双缩脲法测定蛋白质第14页分光光度计基本结构仪器中光源经过单色器中单色原件（如棱镜），所得到单色光（入射光）进入样品室，透出光被受光器（光电池或光电色）产生光电流，放大后在测量仪上显示出吸光度（A）或透光度（T）。光源单色器样品室受光器测量器双缩脲法测定蛋白质第15页722分光光度计使用方法接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热10min;将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内,空白液普通放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应;调好波长;调整按钮开盖时，调T

参数

调为100合上盖，调A参数调为0;逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）;读数完打开样品室盖，再将读数写入统计本。

双缩脲法测定蛋白质第16页722分光光度计使用注意事项样品室盖应轻开轻放；比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗洁净，倒置于滤纸上；倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品；每调换一次波长，都应将空白溶液吸光度调至“0”。双缩脲法测定蛋白质第17页双缩脲法测定蛋白质含量试验目标了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度原理和方法。双缩脲法测定蛋白质第18页蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故能够用来测定蛋白质浓度。在一定浓度范围内，颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。所以可用比色法测定蛋白质浓度。试验原理双缩脲法测定蛋白质第19页紫红色铜双缩脲复合物分子结构双缩脲法测定蛋白质第20页在分光光度法中，许多不吸收光无色物质能够用显色反应变成有色物质，使之能进行比色测定，并能提升测定灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转变成有色化合物反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物试剂叫显色剂。在实际分析中，同一待测组分可与各种显色剂发生显色反应，生成不一样有色物质。为了确保测定灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择标准以下：1.选择性好，干扰少或干扰易消除；2.灵敏度要高；3.生成有色化合物组成恒定，化学性质稳定；4.生成有色化合物与显色剂之间颜色须有显著差异，最大吸收波长之差大于60nm。显色剂与显色反应双缩脲法测定蛋白质第21页管号试剂0123456牛血清标准蛋白溶液（ml）2mg/ml—0.61.21.82.43.00待测蛋白液（ml）——————3.0蒸馏水（ml）32.41.81.20.6