克氏原螯虾虾头的紫外诱导自溶工艺优化及其风味物质分析

克氏原螯虾虾头的紫外诱导自溶工艺优化及其风味物质分析

1929年从日本引进中国后，它在中国推广了水产养殖。2016年我国小龙虾总产量达到89.91万t,是全世界世界最大的小龙虾生产国酶解法具有操作方便、对营养物质破坏小等优点,被广泛应用于动物蛋白的回收。虾头经酶解处理,其产物中含有大量的短肽、氨基酸等鲜味物质,可以开发为虾味海鲜调味品或食品添加剂,具有广阔的市场前景克氏原螯虾的大部分消化器官都集中在虾头,因此虾头中含有丰富的内源蛋白酶。有研究学者报道指出,虾头中存在活性很高的类胃蛋白酶和类胰蛋白酶2种主要蛋白酶1材料和方法1.1仪器、试剂和仪器克氏原螯虾虾头:鲜活的克氏原螯虾(Procambarusclarkia),购于四川省成都市青羊区麦德龙超市,洗净沥干水分后取虾头,分装保存于-20℃备用(虾头基本营养成分为:水分含量(74.13±0.46)%,粗蛋白含量(13.68±0.23)%,粗脂肪含量(5.49±0.14)%,灰分含量(6.68±0.08)%)。IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx标准品(纯度≥99.0%),购于美国Sigma公司;甲醇、乙腈,均为色谱纯;其他试剂均为国产分析纯。DK-98-1型恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;自动凯氏定氮仪,德国Thermo公司;MBL50型高速均质机,上海默格机械有限公司;85-2型恒温磁力搅拌器,北京华人新创科技有限公司;835-50型高速氨基酸自动分析仪,日本Hitachi公司;PB-10型酸度计,德国Sartorius公司;SB-5200型超声波清洗器,上海新芝生物技术研究所;Agilent1200型半制备高效液相色谱仪,美国Agilent公司;CF16RX型高速冷冻离心机,日本Hitachi公司。1.2测试方法1.2.1紫外诱导的原头自溶技术的优化1.2.1.1.技术方法1.2.1.2、紫外诱导克氏原虾的自溶酶分解产物的制备虾头自溶工艺参考曹文红等1.2.1.不同因素对对虾头酶解液水解度的影响紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶反应的固定条件为:紫外照射时间30min,自溶初始pH值8.0,自溶反应温度50℃,自溶反应时间3h。固定其他条件不变,改变其中某个因素条件分别分析对虾头酶解液水解度的影响。设置各因素的梯度分别为:紫外照射时间0、10、20、30、40、50、60min,自溶初始pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,自溶温度35、40、45、50、55、60、65℃,自溶时间0、1、2、3、4、5、6h。反应结束后于80℃加热20min终止反应;于4500r/min离心10min,上清液即为样品液。1.2.1.实验设计与结果分析在单因素实验的基础上,选择对虾头水解度影响较大的紫外照射时间、自溶初始pH值、自溶温度3个因素,按照Box-Bohnken设计法每个因素取3个水平,以(-1,0,1)编码进行实验,以水解度为响应值建立二次响应面数学模型,寻找最佳的自溶条件。共有17个试验,其中12个为析因点,5个为零点以估计误差。每个试验重复3次,试验结果为测定结果的平均值±标准偏差。因素与水平见表1。1.2.2氮的含量测定氨基态氮含量的测定参考NILSANG等水解度(degreeofhydrolysis,DH)的计算公式如下:式中:A为样品中总氮量;B为样品中的氨基氮量;C为样品中的非蛋白氮量。1.2.3感觉评估感官评价采用描述分析法1.2.4游离氨基酸的测定样品用酸水解法处理,然后用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸的含量。1.2.5b出/除1r/min样品前处理:取样品溶液10mL,加入30mL体积分数8%冷的高氯酸溶液均质2min(转速6000r/min)。在4℃条件10000r/min离心20min,取上清液,沉淀重新提取两次,上清液用10mol/L的KOH调节pH6.5,在0℃保存30min以沉淀高氯酸钾,过滤取上清液,用8%冷的高氯酸溶液定容至50mL,4℃保存备用。HPLC条件:色谱柱为WatersC1.2.6处理数据实验结果用平均值±标准偏差表示(n=3),使用Origin8.0和SPSS22.0软件进行作图和数据分析。2结果与讨论2.1不同照射时间对克氏原螯虾虾头水解度的影响紫外照射时间、自溶初始pH值、自溶温度和自溶时间对克氏原螯虾虾头水解度的影响如图1。由图1-a可知,随着紫外照射时间的增加,克氏原螯虾虾头水解度先增加后略有降低,在30min时水解度取得最大值。当照射时间小于30min时,由于紫外线的诱导作用,激活了虾头的内源蛋白酶,促进蛋白质降解,提高了水解效果;照射时间超过30min时,由于紫外线过度作用,使得酶分子的结构发生变化,降低了酶的活性,进而减缓虾头蛋白的水解2.2反应分析在应用表面的结果2.2.1回归方程结果根据Box-Behnken设计方法得到17组试验结果,其设计方案及结果见表2。利用DesignExpert8.0.5软件对响应面试验结果进行二次多元回归分析,对表2的数据进行方差分析并除去不显著项得到模型的二次多项回归方程为:y=44.17+1.43A+1.44B-1.20AC-5.05A由表3可知,模型的P值小于0.0001,而失拟项不显著(P=0.2221>0.05),表明模型是极显著的。另外,因素一次项(A、B)、交互项AC、二次项(A2.2.2因素变化的交互作用对虾头自溶水解度根据回归方程的分析结果,考察紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶工艺中紫外照射时间、自溶初始pH、自溶温度3个因素之间交互作用对水解度的影响如图2～图4所示。图2显示紫外照射时间为30min时,自溶初始pH值和自溶温度对克氏原螯虾虾头水解度的交互影响效应。从图2可知,随着自溶温度的升高,水解度的变化较为平缓。曲面的投影图中,等高线变化趋势近似于一条直线,说明自溶温度与自溶初始pH值交互作用对虾头自溶水解度影响不显著。等高图中形成封闭的圆圈,说明在因素变化范围内出现极大值。图3显示自溶初始pH值为7.0,紫外照射时间和自溶温度对克氏原螯虾虾头水解度的交互影响效应。在测定范围内,随着紫外照射时间的增加,虾头水解度先升高后降低。曲面图的投影图中,等高线变化趋势为一条弧线,这说明紫外照射时间和自溶温度对虾头自溶水解度影响较为显著。另外曲面投影的等值线形成一个封闭的圆圈,说明其在因素变化范围内,出现有最大值。图4显示自溶温度为50℃时,自溶初始pH值和紫外照射时间对克氏原螯虾虾头水解度的交互影响效应。根据曲面投影的等高图,在因素变化范围内,等高线变化趋势较为平缓,说明紫外照射时间与自溶初始pH值交互作用对虾头自溶水解度影响不显著。等高图中形成封闭的圆圈,说明在因素变化范围内存在极大值。2.2.3紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶工艺条件确定为了得到最佳工艺方案,对所得回归方程取一阶偏导数,解方程组后可得:A=22.94,B=7.16,C=50.36,即为紫外照射时间22.94min,自溶初始pH7.16,温度50.06℃,在此条件下克氏原螯虾虾头水解度达44.39%。考虑到实际操作条件,确定紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶最佳工艺条件为:紫外照射时间23min,自溶初始pH7.2,温度50℃,自溶时间3h。为检验回归方程所预测结果的可靠性,在最优条件下进行3次验证性实验,实际测得的虾头蛋白酶解液水解度为(45.88±1.37)%(P<0.05),所得实际值与理论值的平均误差为3.36%。试验结果充分验证了该模型的正确性,所得到的二次多项回归方程可以较准确预测紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶水解度。2.3克氏原虾的外观发生了变化2.3.1虾头蛋白的检测克氏原螯虾虾头原液和自溶产物的感官评定结果见图5。克氏原螯虾虾头经过自溶,蛋白酶解液的腥味和苦味有所减少,同时鲜味和醇厚感味显著增加(P<0.05)。虾头蛋白在自溶过程中,随着内源蛋白酶的作用,虾头蛋白被分解为小分子肽和游离氨基酸。克氏原螯虾虾头自溶后蛋白酶解液中的鲜味,主要来源于酶解过程中产生的鲜味和甜味氨基酸2.3.2虾头自溶前后游离氨基酸含量的变化克氏原螯虾虾头原液和自溶产物中游离氨基酸含量如表4所示。游离氨基酸是克氏原螯虾虾头自溶产物鲜味物质的重要组成成分。鲜味氨基酸主要指一些具有鲜味的L型天然氨基酸,如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu,俗称味精)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala),其中谷氨酸一钠(monosodiumglutamate,MSG)是鲜味物质的典型代表虾头经过自溶后,其自溶产物中游离氨基酸总量为8605.45mg/kg,与虾头原液相比,增加了1.29倍,其中精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量较高,均在700mg/kg以上,此5种氨基酸即占游离氨基酸总量的51.53%。在所有氨基酸当中,精氨酸含量最高,为1085.37mg/kg。精氨酸是略带苦味的甜味氨基酸,与其他氨基酸相互协调,具有增加醇厚感和提高鲜度的作用2.3.3自溶产物的关键成分核苷酸及其关联化合物是影响克氏原螯虾虾头自溶产物中鲜味的另一关键成分。一般认为,鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)具有突出的鲜味,是食品工业中常用的鲜味剂3克氏原螯虾虾头原液和自溶产物的鲜食物质组成克氏原螯虾虾头中含有丰富的内源酶,通过紫外线照射可以诱导其发生自溶反应。通过响应面中心组合设计优化紫外诱导克氏原螯虾虾头自溶工艺参数,从而建立以紫外照射时间、自溶初始pH和自溶温度3个因素对克氏原螯虾虾头水解度的回归模型:Y=44.17+1.43A+1.44B-1.20AC-5.05A通过感官评价和理化指标,对克氏原螯虾虾头原液和自溶产物中的鲜味物质进行分析,结果表明,克氏原螯虾虾头经过自溶后,其腥味和苦味降低的同时,鲜味和醇厚感显著增加(P<0.05);与虾头