生物化学检验实验室基本知识课件

第二章生物化学检验实验室基本知识

1第二章生物化学检验实验室基本知识1本章内容概要：第一节实验用纯水第二节常用临床实验室器材（自学/复习）第三节生物化学检验试剂概述第四节参考范围和医学决定水平第五节实验方法与参考物质概述第六节实验方法的选择与评价第七节实验的临床诊断性能评价2本章内容概要：第一节实验用纯水2教学目的和要求：1、掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验方法与参考物质的分级，实验误差、方法学评价指标以及五种方法学评价试验的目的、原理、操作、计算及注意事项。

2、熟悉实验用纯水的等级、制备和纯度检查，化学试剂的选择、保存与配制，参考范围和医学决定水平的基本概念，实验方法与参考物质的基本概念，实验方法的正确选择，诊断试验的性能评价。3、了解参考范围的建立，溯源性、测量标准、互通性的概念，方法性能判断。3教学目的和要求：1、掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验第一节实验用纯水天然水自来水实验用纯水经简单的物理、化学方法处理，除去悬浮物质和部分无机盐经蒸馏、离子交换、活性炭吸附、超滤等处理，除去杂质(悬浮物,胶体物质,溶解物质)4第一节实验用纯水天然水自来水实验用纯水经简单的物实验室用水等级纯水的制备方法水的纯度检查

内容概括：5实验室用水等级内容概括：5一、实验室用水等级表2-1美国NCCLS等级纯水的规定及用途(1985)级别Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级pH未定未定5.0～8.0电阻率(MΩ·cm,25℃,最大量)102.01.0硅(mgSiO2/L,最大量)0.050.11.0微生物含量（每毫升最大菌落数）10103未定硅（mgSiO2/L，最大量）0.050.11.0微粒0.2µm微孔膜过滤未定未定有机物质活性碳过滤未定未定用途原子吸收，火焰光度，荧光，电解质，酶，高效层析，电泳，参比液，缓冲液。一般实验室检验，器皿冲洗。器皿洗涤，要求不高的定性试验。美国国家临床实验室标准委员会（nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards，NCCLS）

6一、实验室用水等级表2-1美国NCCLS等级纯水的规定及表2-2中国国家验室用水GB6682-2002标准名称一级二级三级pH范围(25℃)－（未定）－5.0～7.5

电导率（25℃）ms/m≤

0.010.100.50

电阻率（25℃，MΩ·cm）≥1010.2

可氧化物质mg/L

＜（以O计）－0.080.40

吸光度（254nm，1cm光程）≤

0.0010.01－

蒸发残渣（105±25℃）mg/L≤－1.02.0

可溶性硅（以SiO2计）mg/L

＜

0.01

0.02－7表2-2中国国家验室用水GB6682-2002标准名二、纯水的制备方法蒸馏法离子交换法其他方法：活性炭吸附法、电渗透法、超滤膜法混合纯化系统8二、纯水的制备方法蒸馏法8（一）蒸馏法优点:设备简单缺点:1、挥发性物质难以去除，有离子干扰；2、耗能大，耗水多；3、需注意管道清洁纯度：Ω·cm（25℃）的蒸馏水（deionizedwater，DW）

9（一）蒸馏法优点:设备简单缺点:1、挥发性物质难以去除，有离(二)离子交换法定义：将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂质离子，称为离子交换法。

原理：扩散离子交换吸附10(二)离子交换法定义：将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂氢型强酸性阳离子交换树脂

(R—SO3H，R为母体)

，其中的H+与Ca2+、Na+等金属离子发生交换反应，而将钙、钠离子除去

氢氧型强碱性阴离子交换树脂(R′—NOH，R′为母体)，其中的OH-与水中的CL-、碳酸根等阴离子发生交换反应，而将它们除去：

离子交换反应11氢型强酸性阳离子交换树脂

(R—SO3H，R为母体)

，其中优点:除了可去除杂质离子以外兼具吸附电中性杂质和过滤颗粒杂质的作用。缺点:

纯度：5MΩ·cm（25℃）以上的去离子水DW

2、由于离于交换为可逆反应，故去离子水并非绝对不含离子

1、设备较复杂，成本较高；（目前实验室应用普遍）12优点:缺点:纯度：5MΩ·cm（25℃）以上的去离子水D（三）其他方法：

在电场作用下水中各种阳离子趋向阴极，各种阴离子趋向阳极．但阳离子只能透过阳膜而被相邻的阴膜所阻，阴离子与此相反．这样，在一些隔间内集中了阳离子和阴离子，即形成含盐多的浓水，在另一些隔间内由于阴、阳离子的迁出降低了含盐量形成淡水

电渗透法13（三）其他方法：在电场作用下水中各种阳离子趋向1、不需要消耗化学药品，设备简单，操作方便。消耗电能，当原水中盐浓度过低时，溶液电阻大，用电渗析也不经济

纯度:25℃时104～105Ω·cm2、对于含盐量高的海水等用此法比用离子交换法更为经济．优点:缺点:电渗透法评价14消耗电能，当原水中盐浓度过低时，溶液电阻大，用电渗纯度:炭吸附法:活性炭是一种非常优良的吸附剂，它是利用木炭、各种果壳和优质煤等作为原料，通过物理和化学方法对原料进行破碎、过筛、催化剂活化、漂洗、烘干和筛选等一系列工序加工制造而成。15炭吸附法:活性炭是一种非常优良的吸附剂，它是利用木炭、各1、设备简单，操作方便。纯水制备效率低,仅作为各种制备纯水配套的一种措施.

2、它具有物理吸附和化学吸附的双重特性,可以有选择的吸附气相、液相中的各种有机物质.优点:缺点:炭吸附法评价:161、设备简单，操作方便。纯水制备效率低,仅作为各种制备纯水配超滤膜法特点:仅能除去胶体细菌等大分子物质和悬浮物,所得水还需进一步纯化.也是作为各种制备纯水配套的一种措施.17超滤膜法特点:仅能除去胶体细菌等大分子物质和悬浮物,所得水还混合纯化系统医用超纯水设备实验室纯水系统橱下式全自动逆渗透纯水机特点:多种方法混合纯化,可获得纯度很高的二级甚至一级纯水.电阻率大于2.0MΩ·cm（25℃）。

18混合纯化系统医用超纯水设备实验室纯水系统橱下式全自动逆渗三、水的纯度检查水电阻率或电导率检查检测残留物含量

1.电阻率工具：电导仪或兆欧表

2.可溶性硅限量试验：以SiO2计。3.细菌菌落计数表示：电导率为每cm长的电导(S/cm)，电导仪的表头读数单位为µS/cm，因此电导仪读数为1时，电阻率为1×106Ω·cm=1MΩ·cm步骤：19三、水的纯度检查水电阻率或电导率检查检测残第二节常用临床实验室器材一、微量加样器的使用微量加样器又称微量移液器、微量进样器。其下端为可装卸、可更换的尖管形移液嘴（吸头），上方是控制采样的推进按钮。

有固定式和可调式两种类型，规格有µl级、ml级。20第二节常用临床实验室器材一、微量加样器的使用微量工作原理微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负压吸入定量的液体，其吸液量由活塞在活塞套内移动的距离来确定，再按下按钮使活塞向下移动，排出活塞腔内的气体而将吸头内的液体排出。21工作原理微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负1.选择在移液范围内的加样器，若为可调式则先将容量调节到所需的容量上。2.将吸头套在加样器的下端，轻轻转动后牢固地套上，确保密封。3.正式使用前需连续按动数次（不吸液体），以保持腔内外气压一致。4.用手垂直握住加样器，拇指将按钮压至第一停点（第一档位），并将吸头浸入到液面下1～3mm，再缓慢地放松按钮使之复位，等待1～2s后从液体中取出时拖靠掉吸头外部残液于被取出的容器内壁中。注意避免吸头与其他任何东西碰撞。5.将吸头移到加样容器内壁上，轻轻地将按钮压至第一停点将液体排出，等待1～2s，再把按钮压至第二停点（第二档位），排尽全部液体后，吸头应沿容器壁向上滑动取出，此时拖靠吸头内部残液于加样容器内壁中。再放松按钮使之复位，卸下吸头，完成一次操作过程。操作方法22操作方法22第三节生物化学检验试剂概述化学试剂的种类与保存化学试剂的配制试剂盒的选择及评价23第三节生物化学检验试剂概述化学试剂的种类与保存23

一、化学试剂的种类与保存

1.一级优级纯（G.R）又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液.2.二级分析纯（A.R）又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析.3.三级化学纯（C.P），蓝色标签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性试验.4.四级实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低、但比工业用高，适用于一般定性实验.普通生化检验准确的定量分析或配制校准溶液

（一）化学试剂的种类

24一、化学试剂的种类与保存1.一级优级纯（G.R）又（二）化学试剂的保存保存原则:①按液体、固体性状分类，同时按序排列并作好登记，贮于干燥阴冷处。②对于易燃、易挥发的药品应用蜡封瓶塞，贮于干燥阴冷处或冰箱内。③强酸、强碱试剂应分别存放。④剧毒药品则应由专人管理，每次使用应记录用量并做好登记。

25（二）化学试剂的保存保存原则:25二、化学试剂的配制配制方法：

直接配制法：适用于校准液和一般试剂的配制。

间接配制法：适用于不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，即先配制大概浓度，然后再用校准液标定出准确浓度。

26二、化学试剂的配制配制方法：直接配制法：适用于校准液和一①固体试剂恒重后准确称量②液体试剂取量时选择合适的量器准确吸取要求的体积③试剂配制的溶剂一般为蒸馏水或去离子水，应注意对蒸馏水的要求，若需其他溶剂则需注明清楚。④各类试剂分别溶解后按要求顺序混合，最后稀释至刻度。⑤配制好的试剂应在其容器上注明名称、浓度以及配制时间。

注意事项：27①固体试剂恒重后准确称量注意事项：27三、试剂盒的选择及评价试剂盒定义：用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合。

28三、试剂盒的选择及评价试剂盒定义：用于检验项目测定的含有使用（一）试剂盒的选择生化检验商品试剂盒包装类型：液体、干粉（片）、冻干。液体型试剂盒：单试剂或双试剂

优点：均一性好、瓶间差异较小、重复性好、不需复溶而可避免外源性水质的影响、测定结果较为准确等

不足：之处在于保存时间较短（特别是酶试剂）、不便于运输

29（一）试剂盒的选择生化检验商品试剂盒包装类型：液体、干粉（片冻干型试剂：试剂溶解后先分装成液体，再经冻干处理而成

。干粉（片）型试剂：各种干燥的化学试剂经粉碎混合（压片）而成优点：易于保存。不足：分装过程中的称量以及加工过程中的混合均易造成瓶间差；复溶对水的质与量要求较高，同时复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。优点：易于保存，各组份的混合相当均匀不足：试剂中残留的含水量不易准确控制，易造成瓶间差；复溶对水的质与量要求较高复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。30冻干型试剂：试剂溶解后先分装成液体，再经冻干处理而成。干（二）试剂盒的评价

完整牢固的内外包装详尽明确的说明书优良的试剂外观

2.性能指标评价（根据国家卫生部颁发的试剂盒质量检定标准）

准确度精密度干扰线性范围稳定性反应时间曲线

评价前校正仪器、量器，严格控制实验条件，由熟练的技术人员操作

31（二）试剂盒的评价完整牢固的内外包装2.性能指标评价（稳定性试验稳定性试验是指试剂盒的不同状态在不同条件下贮存后所能保持测定准确性的性能。状态：原包装及配制的工作液，条件：室温、冰箱温度，最终指标：有效期（一般指标为试剂空白和高值样本吸光度的变化范围等）。32稳定性试验稳定性试验是指试剂盒的不同状态在不同条件下第四节参考范围和医学决定水平参考范围33第四节参考范围和医学决定水平参考范围33临床生化检验项目的结果的临床意义

正常还是异常，是否及如何给予医疗措施，疗效如何等

医学决定水平

临界值：确定病情、判断疗效和预后项目参考范围区间：解释结果正常与否34临床生化检验项目的结果的临床意义正常还是异常，是否及如何、参考范围（一）参考范围的建立（了解）建立包含内容：参考个体参考总体参考抽样组（参考样本）参考值参考分布参考值范围参考值区间等35、参考范围（一）参考范围的建立（了解）建立包含内容：参考个体(所有参考值剔除离群值并补充数据后在95％的分布范围)（参考范围）36(所有参考值剔除离群值并补充数据后在95％的分布范围)（参建立的注意事项：①参考抽样组人数一般为100例以上；

②离群值的判断与处理；

③项目偏高、偏低均属异常的为双侧参考值区间，项目只偏低或只偏高属异常的则取单侧参考值区间，正态：x－或x

＋1.65s；偏态：P5或P95的参考限；④参考值范围、参考值区间、参考范围；⑤参考范围并非一成不变的，不能机械地进行比较。

37建立的注意事项：①参考抽样组人数一般为100例以上；②离（二）参考范围概念的正确使用正常值”、“正常值范围”、“正常范围（不合理）

参考范围（IFCC推荐）“正常范围”等使用不合理的原因在于：

①“正常”是相对的。②是正常的人被判为“不正常”。③不正常的人被纳入“正常”。38（二）参考范围概念的正确使用正常值”、“正常值范围”、“正常二、医学决定水平概念：是指临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。MDL，DL（或用XC表示）可以用来除外或确定某一临床情况或预告将会出现的某一生理变化现象。图2-1健康与疾病的理论分布健康人群疾病患者DL1、DL2分别为低值、高值医学决定水平，DL1左侧的数值可除外B组疾病；DL2右侧的数值可确定患者存在B组疾病；DL1与DL2之间则表明健康与疾病存在交叉

参考范围39二、医学决定水平概念：是指临床上按照不同病情给予不同处理的指特点：不同指标的ＭＤＬ的数量和数值不同40特点：不同指标的ＭＤＬ的数量和数值不同40血清清蛋白（Alb）有三个DL，分别是20g/L、35g/L、52g/L。其中20g/L表示肝病患者的预后严重；35g/L为检查低清蛋白血症的界值；52g/L则稍高于参考范围上限，可除外许多假阳性。

医学决定水平举例：血清钙有三个DL，分别是1.75mmol/L、2.75mmol/L、3.38mmol/L。1.75mmol/L作为低血钙抽搐的第一个决定性水平值，等于或低于1.75mmol/L时，应加做其他检查以明确病人发生抽搐的可能性，并采取预防措施；2.75mmol/L作为观察副甲状腺功能是否亢进的血清钙低限值，等于或高于该值时，应加做其他检查以确诊或排除原发性副甲亢的诊断；若大于3.38mmol/L则考虑为高血钙昏迷，应及时做出诊断，不得延误

41血清清蛋白（Alb）有三个DL，分别是20g/L、35g/L第五节实验方法与参考物质概述实验方法（测量方法）

测量程序

下一级方法

下一级测量程序

常规样品

产生

定值

校准

评价同一级参考物质

定值

下一级参考物质

42第五节实验方法与参考物质概述实验方法（测量方法）测量决定性方法参考方法常规方法43决定性方法参考方法常规方法43一、实验方法的分级

（一）相关基本概念（ISO定义）1．测量方法(methodofmeasurement)进行测量时所用的、按类别叙述的逻辑操作次序

2．测量程序(measurementprocedure)用于特定测量的、根据给定的测量方法具体叙述的一组操作3．真值与给定的特定量的定义一致的值称为真值(truevalue)。在实际工作中经常使用的是约定真值

4．约定真值对于真值具有适当的不确定度，赋予特定量的值，有时它是通过约定而被采用的值，称为约定真值(conventionaltruevalue)，常用某量多次测量的平均值来确定约定真值

5．不确定度(uncertainty)，评价方法的属性，与测量结果的分散性相联系的参数测量结果的分散性

非重复测量因素造成的结果不确定性

+44一、实验方法的分级（一）相关基本概念（ISO定义）1．测量（二）实验方法的分级分级依据：IFCC根据分析方法的准确性与精密度的不同。决定性方法参考方法常规方法分为三级：45（二）实验方法的分级分级依据：IFCC根据分析方法的准确性与1.决定性方法（definitivemethod）定义：

是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，其测定结果与“真值”最为接近。主要方法：重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）461.决定性方法（definitivemethod）定义：主应用：由于技术要求太高，费用昂贵只用于产生一级测量程序、评价参考方法。不直接用于鉴定常规方法的准确性储氢重量分析仪一级参考物质一级测量程序决定性方法产生

定值（注：一级测量程序适合纯物质的鉴定，不适合作生物基质样品的分析）

47应用：储氢重量分析仪一级参考物质一级测量程序决定性方法产生2.参考方法（reference

method）定义：是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。主要方法：

原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等分类：①公认的参考方法②推荐的参考方法

482.参考方法（referencemethod）定义：主要方应用：

主要用于鉴定常规方法，评价其偏差、干扰因素，并决定是否可以被接受；产生二级参考测量程序（适合于分析复杂生物样品）用于鉴定二级参考物和为质控物定值；用于商品试剂盒的质量评价；参考方法可以产生出更低等级的厂家选定测量程序、厂家常务测量程序、用户常规测量程序，分别为厂家工作校准物、厂家产品校准物和常规标本定值。49应用：49国际约定参考测量程序(internationalconventionalreferencemeasurementprocedure)

它们得出的结果不能溯源至SI单位，但被广泛承认。其可以为厂家工作校准物定值。应用：一级、二级、国际约定参考测量程序可统称为参考测量程序定义：比二级参考测量程序等级低的一类程序。50国际约定参考测量程序它们得出的结果不能溯源至SI单位3．常规方法（routinemethod）定义：

应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目的的需要。主要方法：溴甲酚绿法双缩脲法J-G法等偏差已知方法偏差未知方法分类：根据准确度确定与否

513．常规方法（routinemethod）定义：主要方法应用：临床常规检验使用常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法（recommendedmethod

）

产生用户常规测量程序

我国临床检验中心推荐的常规方法是葡萄糖氧化酶法,己糖激酶法是国际上推荐的参考方法。52应用：我国临床检验中心推荐的常规方法是葡萄糖氧化酶法,己糖激二、参考物质的分级（一）相关基本概念（ISO定义）1．参考物质：具有一种或几种理化性质已经充分确定的特性，用以校准仪器、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质，称为参考物（referencematerialRM）。国内多称为标准物质、标准物、标准品。

2．测量系统(measuringsystem)：完成一个项目所涉及的仪器、试剂、校准物、测量程序、质量控制、保养计划等的组合，又称检测系统。3．溯源性(traceability)、溯源链：4．参考实验室参考测量实验室的简称，是运行参考测量程序、提供有给定不确定度的测量结果的实验室。

53二、参考物质的分级（一）相关基本概念（ISO定义）1溯源性(traceability)、溯源链定义：通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家或国际测量标准相联系起来的特性，称为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链。

特点：溯源性是测量结果（包括测量标准即校准物的测量结果）的属性，不宜用于测量方法或测量程序。了解54溯源性(traceability)、溯源链定义：通过一条具有溯源链的理想终点是SI单位的定义，但目前只有少部分检验项目可以溯源至SI单位

连续的比较链是指计量学级别由低到高的、交替出现的测量程序和校准物。55溯源链的理想终点是SI单位的定义，但目前只有少部分检（二）参考物质的分类与分级分类：按功能参考物质

校准物质：又称校准物(calibrator)，是在校准函数中其值被用作自变量的参考物质(对测量系统校准或对材料赋值)。

正确性质控物质：（国内多称为质控物、质控品、控制物）是用于评价一种测量系统的测量偏差的参考物质

质控物不能当作校准物使用，校准物也不能当作质控物使用

定值血清非定值血清冻干质控物（血清）混合血清液体质控物（血清）按有无测定值按物理形状56（二）参考物质的分类与分级分类：按功能参考物质校准物质：又参考物质可以是纯的或混合的液体、固体（如镨钕滤光片）或气体（如标准的CO2气体）。57参考物质可以是纯的或混合的液体、固体（如镨钕57分级：根据参考物质的校准性质分为：1．一级参考物质（一级校准物、原级参考物、一级标准品）

定义：是一种高度稳定而均一的物质，所含的杂质已经定量。具有最高计量学特性的参考物质，是测量单位的具体体现。其值由决定性方法产生的一级参考测量程序确定。应用：校准二级参考测量程序以及为二级参考物质定值。一级参考物质、二级参考物质、工作校准物三级58分级：根据参考物质的校准性质分为：1．一级参考物质（一级校准（二级校准物、次级参考物、二级标准品）2．二级参考物质定义：由二级参考测量程序定值，可以是与实际临床样品基质相似的物质。应用：校准试剂盒厂家选定测量程序。在发达国家的二级参考物质通常是有证参考物质。需要强调的是，只有对于可溯源至SI单位的小分子检验项目，才可分为一级参考物质和二级参考物质。

59（二级校准物、次级参考物、二级标准品）2．二级参考物质定义：3．工作校准物(workingcalibrator)(一般参考物质）工作校准物

分类：厂家工作校准物厂家产品校准物（主要）厂家选定测量程序厂家常务测量程序定值定值有证参考物质和一般参考物质的区别是前者有明确的溯源性和不确定度要求

603．工作校准物(workingcalibrator)(一般国际约定校准物质定义：它们的量值不能溯源至SI单位，但属于国际约定的，因而也被广泛承认。由国际约定参考测量程序定值。应用：校准厂家选定测量程序。

61国际约定校准物质定义：它们的量值不能溯源至SI单位，但属于决定性方法参考方法常规方法国际约定校准物质国际约定参考测量程序62决定性方法参考方法常规方法国际约定校准物质国际约定参考测量程第六节实验方法的选择与评价

实验方法为临床提供准确可靠的信息临床生化检验分析保证应用实验方法的选择和评价63第六节实验方法的选择与评价实验误差方法学评价指标实验方法选择与评价的原则、内容和步骤方法学评价试验

方法性能判断主要内容：64实验误差主要内容：64、实验误差（一）概念实验误差简称误差（error），指测量结果与被测量的真值的差异。（约定真值）周期性系统误差图2-3误差的分类误差系统误差随机误差恒定系统误差可变系统误差比例系统误差复杂系统误差已定系统误差未定系统误差（二）分类根据变化性质不同，误差可以分为系统误差和随机误差两大类65、实验误差（一）概念实验误差简称误差（error），指测量结1.系统误差（systematicerror，SE）

定义：相当于不准确度（inaccuracy）或偏倚（bias），指重复多次测量的结果均值（X）与真值（T）之差。

特点:①具有单向性，而没有随机性，常有一定的大小和方向；

②增加测定次数也不能消除。661.系统误差（systematicerror，SE）定义系统误差分类：按变化规律

恒定系统误差（CE）：由干扰物引起的大小恒定的误差，该误差与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关，因此有正负之分。能够修正可变系统误差：比例系统误差（PE）：周期性系统误差复杂系统误差指与被测物浓度的变化而成比例变化的误差，能够修正。

周期性出现的误差，能够修正。

方向和大小未知或部分未知但通常可以估计其界限，其中的一部分可以在测试中加以消除。67系统误差分类：按变化规律恒定系统误差（CE）：由干扰物引造成系统误差的主要原因：①方法误差：主要是由于方法分析性能存在固有缺陷所致如方法特异性不高、样本中非测定成分的干扰物等；

②仪器和试剂误差：主要见于仪器波长未经校正、量器不准、试剂质量不好等造成。

最严重，最难避免68造成系统误差的主要原因：①方法误差：主要是由于方法分析性能2.随机误差（randomerror，RE）定义：相当于不精密度（imprecision），或绝对偏差（di），指某次测量值（xi）与重复测量的结果均值（X）之差

特点:①可正可负、大小不定

；

②分析步骤越多，造成这种误差的机会就越多。③增加测定次数，其算术均值接近于真值，数据呈正态分布

。④不可避免、必然出现的，但可控制在一定范围内。692.随机误差（randomerror，RE）定义：相当于常用表示方法：最常见的：标准差（s）、变异系数（CV）

造成随机误差的原因：①技术人员的操作不规范②仪器、试剂、环境因素等条件的突然改变。70常用表示方法：最常见的：标准差（s）、变异系数（CV）造成系统误差随机误差引起两种误差的原因是相对的71系统误差粗大误差（parasiticerror）定义：指错读示值、使用有缺陷的计量器具、计量器具使用不正确、环境干扰等造成的大误差，称为粗大误差，或称为疏失误差、过失误差、粗差。处理：粗大误差为离群值，要被剔除72粗大误差（parasiticerror）处理：粗大误差为（三）误差的表示方法1.绝对误差（偏差）：指某次测量值（xi）与真值（T）之差：绝对误差＝xi－T（单次）或bias＝x－T（平行）

2.相对误差指绝对误差占真值的百分比：描述准确度描述准确度描述精密度73（三）误差的表示方法1.绝对误差（偏差）：指某次测量值（x描述精密度1.标准差即标准偏差(standarddeviation，s)的简称。它是方差（s2）的平方根值。其单位与原始数据单位相同，测定次数一般要求20次（n=20）以上。

74描述精密度1.标准差即标准偏差(standarddev2.变异系数(coefficientofvariation，CV)指样本标准差与样本均值的百分比，它主要用于比较各组数据间的离散度，没有单位。CV值越大，反映各组数据间的变异越大，精精密度越差。

752.变异系数(coefficientofvariatio4．平均偏差：指各绝对偏差（di）取绝对值后的算术平均值5．相对偏差指某次测量的绝对偏差占测定均值的百分比：

6．相对平均偏差指平均偏差占测定均值的百分比：3.绝对偏差指某次测量值（xi）与重复测量的结果均值（X）之差764．平均偏差：指各绝对偏差（di）取绝对值后的算术平均值5二、方法学评价指标精密度准确度灵敏度、检测限与生物检测限互通性、特异性与干扰线性范围与测量范围

77二、方法学评价指标精密度77（一）精密度定义：精密度(precision)表示对同一样本在规定条件下多次重复测量结果之间或各次结果与均值之间的符合程度。它反映的是随机误差的大小。表示方法：标准差（s）、变异系数（CV）[需注明重复次数（n）和均值（X）]

分类及评价方法：普通化学分析方法的精密度生化检验方法的精密度78（一）精密度定义：精密度(precision)表示对同一样本

（1）平行双样的相对偏差：一个样本分成两管同步平行测定

（2）一组测量值的标准差：一个样本分成n份同一批测定

79（1）平行双样的相对偏差：一个样本分成两管同步平行测定（（3）重复性标准差（sr）定义：是指同一观测者在同一实验室对同一样本用同一仪器、同一试剂和校准物（试剂盒）在尽可能短的时间内进行多次重复测量结果的一致性（“五同一短”）。计算：在相同条件下，对某一样本进行m轮n次的重复测定，各轮重复测量次数n相同，可计算重复性标准差（sr）表示重复性精密度： r r

（i=1，2，3，…..m）（i=1，2，3，…..n）80（3）重复性标准差（sr）计算：在相同条件下，对某一样本进行（4）再现性标准差（sR）（多用于实验室间的质量评价）定义：在改变了的测量条件下，考察同一样品的各测量结果的一致性（“一同”）。改变了的测量条件包括：观测者、实验室、时间、方法、仪器、试剂、校准物等，也可以保持方法不变来考察。最后报告统计学数据时要详细说明测量条件。

计算：假定对同一样本在不同的实验室测量，或者同一实验室在不同时期测量，进行了m轮n次的重复测定，以sR表示再现性精密度（reproducibilityprecision，复现性精密度）计算各轮的标准差si；计算重复性标准差（sr）；计算室间（组间）标准差sL；计算再现性标准差（sR）；（i=1，2，3，…..m）R81（4）再现性标准差（sR）（多用于实验室间的质量评价）定义2.生化检验方法的精密度（1）常见的精密度试验（重复性试验）

1）操作选择高低浓度的2个稳定样本（浓度水平数可以是3个，种类可以是混合血清、质控物），做批内和天间（即日间）重复测量。批内：将2个评价样本随机插入病人样本序列同时测定，一批各20次。天间：每天随同病人样本测定2个评价样本各1次，各累积20次

2）计算将2个水平的样本结果分别按批内、天间排序，分别计算均值（X）、标准差（s）、变异系数（CV）

3）不精密度的判断标准

①推荐标准：批内不精密度CV、天间不精密度CV应分别小于允许分析误差（EA）的1/4、1/3(EA,CLIA′88)

s≤EA

③其它标准：822.生化检验方法的精密度（1）常见的精密度试验（重复性试8383（2）平行样本测量的标准差：适用于平时做得很少的样本，或很难保存的样本，或者没有合适的质控物

1）操作随机选取10份（n=10）高低浓度的新鲜病人样本，每份平行做2次

2）计算计算均值和标准差。标准差的计算公式

3）评价该法受样本例数n、浓度的影响很大，得到的标准差不稳定。仅做了一批试验，不能代表天间变异84（2）平行样本测量的标准差：1）操作随机选取10份（n=1（3）美国NCCLS的精密度评价方案（总精密度试验）EP5-A

取高低浓度的2个稳定样本，每个样本每天测定2批次（批间间隔不得少于2h），每次测定均作双份，共做20天。因此一共是20×2×2＝80个结果。按EP5-A的公式计算批内、批间、天间、总标准差，及相应的变异系数。判断：批内、批间、总CV应分别小于1/4EA、1/3EA、EA（EA来自于CLIA′88）；同时做标准差估计和F检验.

操作与计算:85（3）美国NCCLS的精密度评价方案（总精密度试验）EP5-（二）准确度（accuracy）定义：指测定值与真值（T）之间的符合程度,采用多次反复测定的平均值（x）即约定真值来代表真值。表示方法：1.绝对误差（偏差）：指某次测量值（xi）与真值（T）之差：绝对误差＝xi－T（单次）或bias＝x－T（平行）

2.偏差系数或相对误差指绝对误差占真值的百分比：86（二）准确度（accuracy）定义：指测定值与真值（T）之评价方法：即方法学评价试验。回收试验干扰试验方法比较试验线性范围试验87评价方法：即方法学评价试验。回收试验87（三）灵敏度、检测限与生物检测限1.灵敏度（sensitivity，S）定义：是指检测信号变化量（Δy）与被测物变化量（Δx）的比值，又称为敏感度意义：反映仪器、试剂对样本浓度变化的反应能力88（三）灵敏度、检测限与生物检测限1.灵敏度（sensitiv应用：吸收光谱分析中A-C曲线呈线性时的斜率（ΔA/ΔC）即为反应的灵敏度，显色反应的颜色越深，则灵敏度越高。特点：①吸光系数与灵敏度成正比，灵敏度有计量单位；②灵敏度的高低应按照其样品的医学决定水平（Xc）来选择合适的化学反应，并不是灵敏度愈高愈好。89应用：特点：892.检测限（DL、D；或LOD）相对检测限（质量）绝对检测限（浓度）定义：在给定的置信水平上能够检出被测物的最小浓度或最小质量，又称检出限、检测低限、检出低限。表示方法：检测出信号为3sb时的样本浓度=Δyk值取3（99.7%可能）902.检测限（DL、D；或LOD）相对检测限（质量）定义：3.生物检测限（BLD，生物检出限）表示方法：定义：某浓度的样本单次检测所具有的最小响应信号刚大于空白检测限响应信号，其浓度称为生物检测限，或称为生物检出限测定方法：

用空白血清溶解校准物，配制一系列从最低到逐渐升高的校准液，加试剂反应后测定响应信号，按式2.16求出检测限D并找到相应浓度管，再求出各个比其浓度渐升的校准液的响应信号与3s检测限样本的差值，与检测限D进行比较，≥D的最低校准液浓度即为BLD。检测限与灵敏度的关系913.生物检测限（BLD，生物检出限）表示方法：定义：某浓度（四）互通性、特异性与干扰互通性(commutability)指用不同测量程序测定参考物质时的测定结果之间的数字关系，与测定临床样品时测定结果的数字关系的一致程度，又称为互换性、替换性等。基质效应(matrixeffect，基体效应、介质效应)：被测物以外的某种样品特性对测定因而对被测物的值的影响。影响量①干扰(interference)干扰物本身不产生测定信号，但它增大或减小测定值。②非特异性(unspecificity)影响量本身产生测定信号特异性(specificity)即专一性，指在特定实验条件下分析试剂只与被测物起反应，而不与其它结构相似的非被测物发生反应。92（四）互通性、特异性与干扰互通性(commutability线性范围（linearrange）指检测信号与被测物浓度呈线性时的被测物浓度范围。测量范围（measuringrange，分析范围）指在允许误差极限内所能检测的被测物浓度范围。线性范围测量范围线性测定方法线性范围应该足够宽，至少应包含95％的临床样本。太窄后容易导致系统误差。（五）线性范围与测量范围93线性范围（linearrange）指检测信号与被测物浓度呈三、实验方法选择与评价的原则、内容和步骤（一）实验方法选择的原则指所选的方法简便、快速、价廉、安全等。指所选的方法相对精密、准确、特异、稳定、灵敏且有较宽的测量范围，能够保证检测结果的准确性符合方法的允许误差。94三、实验方法选择与评价的原则、内容和步骤（一）实验方法选择的（二）实验方法评价的基本内容实验方法评价的基本内容：

通过一系列评价试验，检测能表示其精密度和准确度的相应误差类型及大小与规定的性能指标相比较，决定候选方法能否可以接受。95（二）实验方法评价的基本内容实验方法评价的基本内容：95（三）实验方法选择与评价的步骤查阅文献确定候选方法初步评价试验最后评价试验评价后试验方法应用96（三）实验方法选择与评价的步骤查阅文献96四、方法学评价试验（一）重复性试验（二）回收试验

（三）干扰试验（四）线性范围试验（五）方法比较试验（对比试验）97四、方法学评价试验（一）重复性试验97重复性试验目的：检测候选方法的随机误差，考察其精密度。方法：将同一材料分成数份，对其进行反复多次的测定，计算出均值（x）、标准差（s）、变异系（CV）。原理：批内重复性测定是将1份稳定样本随机插入临床血清样本序列中测定，做批内重复测量，所得的批内不精密度CV应小于允许分析误差（EA）的1/4为合格。EA采用CLIA′88可接受范围指标。98重复性试验目的：检测候选方法的随机误差，考察其精密度。989999

一般要求批内CV＜5％

实验操作100一般要求批内CV＜5％实验操作100注意事项（了解）4.不能单独将重复样本设为一组测定20次，而应该与临床血清样本随机排序后穿插测定。Ga.n101注意事项（了解）Ga.n101回收试验目的：用来考察候选方法对加入到常规分析样品中的纯分析物含量进行准确测定的能力，其目的是检测候选方法的比例系统误差（PE），以恒量该方法的准确度。意义：测得的比例系统误差（PE）值随被测物浓度的增加而增加。实验内容102回收试验目的：意义：实验内容102原理：

将浓度已知的含被测物的各校准液加入至病人样品（原样品）中成为一系列分析样品（回收样品），在原样品中加入相同体积的无被测物的溶剂作为基础样品，用候选方法对这些样品进行同步测定，计算回收率、平均回收率，考察候选方法的比例系统误差。一般项目的平均回收率应在95％～105％之间。103原理：103试剂：

收集无肝炎病毒污染、无溶血、无脂浊的人（或动物）血清，采用候选方法测定其浓度，并用生理盐水稀释至3.0mmol/L。浓度分别为：36.0mmol/L、70.0mmol/L。GOD-POD法测定血糖试剂104试剂：104操作步骤：1.样品制备：

原样品：混合血清

基础样品：混合血清0.9ml+蒸馏水0.1ml

回收样品1：混合血清葡萄糖校准液

回收样品2：混合血清葡萄糖校准液2.血糖浓度测定按照GOD-POD法对以上各样品进行双份检测，结果取平均吸光度值、平均浓度值。105操作步骤：105计算：1.计算公式：106计算：1.计算公式：1062.将所有计算结果填入表1072.将所有计算结果填入表107注意事项：1.样品类型：基础样本和回收样本体积一致；2.所加校准液的基质：尽量与样本基质一致，避免基质效应；3.加入校准液的体积：不超过体积的10%；4.准确加量：吸量不准确影响计算；5.加入校准液的浓度：比欲增加的浓度高10倍，加入后使被测物浓度达到医学决定水平。108注意事项：1.样品类型：基础样本和回收样本体积一致；1086.重复测定次数：依加入浓度的高低和方法学本身的随机误差而定；7.可用比较方法测定回收率：可估计回收试验结果的可靠性，还可评价操作误差。：考察被测物浓度是否达到Xc，考察稀释过程的准确性，计算该法测得样本的准确值。9.评价标准：一般的实验方法要求回收率在95％～105％之间。理想的回收率为100％。比例系统误差＝平均回收率－100％，理想的比例系统误差为0。1096.重复测定次数：依加入浓度的高低和方法学本身的随机误差而定如果某回收率为98％，原样本的测定值为10.0mmol/L，求该法的比例系统误差，比例系统误差值，用该法测得原样本的准确值。

回收试验习题110如果某回收率为98％，原样本的测定值为回收干扰试验实验内容目的：

意义：

误差的大小与被测物浓度无关，只随干扰物的浓度而变化。当样本中干扰物浓度一定时，产生恒定量的误差。

干扰试验用于检测某物质（干扰物）加到样品中所产生的恒定系统误差。该试验可同时考察非特异性与干扰，从而评价候选方法的准确性。111干扰试验实验内容目的：意义：干扰试验用于检测某物质（原理：

将可能引起干扰的物质配成一系列浓度的溶液加到病人样品中成为若干个干扰样本，在原样品中加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样品，均用候选方法测定，各干扰样本与基础样品结果之差表示一定浓度下该干扰物质产生的干扰值（偏差）。

112原理：112试剂：

同回收试验的混合血清。浓度为：4.5mmol/L和9.0mmol/L。称取90mg碳酸锂（AR）溶于40ml蒸馏水中，加热至60℃使其完全溶解。准确称取的尿酸1513mg（分子量为168.11）溶于热碳酸锂溶液中，冷至室温，转入100ml容量瓶加蒸馏水至刻度，浓度为9.0mmol/L，棕色瓶贮存。临用前取出1.0ml用蒸馏水作对倍稀释后为4.5mmol/L。GOD-POD法测定血糖试剂

113试剂：113操作步骤：1.样本制备：

原样品：混合血清

基础样品：

干扰样本1

干扰样本22.血糖浓度测定对以上各样品按GOD-POD法双份测定，结果取平均吸光度值、平均浓度值。114操作步骤：114计算：1.计算公式：115计算：1.计算公式：1152.将所有计算结果填入表1162.将所有计算结果填入表116注意事项：1.干扰物质：方法的化学反应原理找出可能的干扰物2.可疑干扰物浓度：确定造成分析结果影响临床应用价值的最低可疑物浓度值3.干扰物溶液体积与测定次数：同回收试验①设立样品和试剂空白②采用各种物理、化学的方法分离③采用双波长或多波长法④若误差太大而又无法消除，则应改进或更换方法117注意事项：1.干扰物质：方法的化学反应原理找出可能的干扰物5.设置原样品的作用①考察稀释过程的准确性②计算该方法消除偏差后对样品所测得的准确值

若干扰值即偏差≤允许误差（EA）的临界值，则干扰物所引起的偏差可以初步接受，进一步判断见后述的方法性能判断。1185.设置原样品的作用118干扰试验习题某血糖测定样本浓度为6.5mmol/L，通过干扰试验求得每mmol/L的尿酸的平均干扰值为，求当尿酸浓度为0.4mmol/L时，该法测得的恒定系统误差值以及血糖标本的实际浓度。119干扰试验习题某血糖测定样本浓度为6.5mmol线性范围试验目的：是考察候选方法的准确性和实用性，通过线性范围的测定选择该线性分析方法的分析范围。应用：在吸收光谱分析中，测定一定实验条件下的被测物符合比尔定律的浓度范围（即线性范围），使具有临床意义的测定值都能够限定在此范围之内。偏离比尔定律的原因：①化学偏离；②仪器偏离120线性范围试验目的：是考察候选方法的准确性和实用性，通过线性原理：配制一系列不同浓度的葡萄糖校准液，采用GOD-POD法测定各自的吸光度。然后以校准液浓度为横坐标、相应吸光度为纵坐标绘制出校准曲线，以了解候选方法的线性范围。121原理：121操作：122操作：122二、绘制A-C曲线在坐标纸上，以吸光度A为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标绘制A-C曲线123二、绘制A-C曲线123方法比较试验目的：是检测候选方法的系统误差，包括恒定系统误差和比例系统误差，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法可否被接受的重要试验。原理：利用候选方法与比较方法即准确度已知的参考方法，同时测定一组病人样品，观察两者之间的差异，以评价侯选方法测定某指标的总系统误差。124方法比较试验目的：是检测候选方法的系统误差，包括恒定系统误操作步骤：125操作步骤：125三、统计学检验1、相关与回归：计算出a、b、r及t值，进行r的t检验。126三、统计学检验1262、配对t检验：计算出d、sd及t值，进行两种方法间的配对t检验。注意事项：1272、配对t检验：注意事项：127五、方法性能判断方法的选择方法的评价方法性能判断常规检验实验误差某一确定的允许误差某一确定的允许误差方法性能标准(PS):运用统计方法制定出一系列医学决定水平上的９５％标本允许误差限度128五、方法性能判断方法的选择方法的评价方法性能判断常规检验某（一）方法学性能标准：１、允许分析误差：依据Westgard制定的９５％标本的允许误差限度，或者９５％的病人标本其误差应小于这个限度，用ＥＡ表示。ＥＡ是大量研究,运用统计学方法制定出的。２、医学决定水平：对临床病人的诊疗具有医学判断作用的临界分析物浓度，用Ｘc表示。Ｘc代表一个阈值。每个检测指标有一个或多个阈值。性能指标:ＥＡ和Ｘc组成某方法的性能指标。即某方法在一定XC下的ＥＡ值。129（一）方法学性能标准：１、允许分析误差：依据Westgard

制定性能标准，要反映临床应用与解释结果的要求（医学效用限度），又要基本符合实验室所能做到的技能状态。方法学性能标准制定原则130制定性能标准，要反映临床应用与解释结果的要求（医学效用限目前所采用的标准：查表时将靶值T换为EA值即可

131目前所采用的标准：查表时将靶值T换为EA值即可131（二）方法性能判断指标（了解）判断标准：各种误差值＜确定的允许误差值ＥＡ

：

方法可以接受任何一项各种误差值＞

确定的允许误差值ＥＡ：

方法不能接受性能判断指标：两套第一套：单值判断指标：简单，用于初步估量第二套：可信区间判断指标：复杂，对方法性能评价更客观，用于最后判断132（二）方法性能判断指标（了解）判断标准：各种误差值＜确定１、单值判断指标133１、单值判断指标1332.可信区间判断指标EU代表误差的可信上限，EL代表误差的可信下限，采用95%可信上限和95%可信下限计算各项试验误差1342.可信区间判断指标EU代表误差的可信上限，EL代（1）若EU＜EA，以95%的可能性接受候选方法。（2）若EL＞EA，以95%的可能性拒绝候选方法。候选方法必须改进，以减少误差，否则被拒绝使用。（3）若出现EU＞EA且EL＜EA时，则说明此时仅有的数据不足以做出任何有关可接受或可拒绝的结论，还需要进一步试验以增加数据，再做较完整的估量。可信区间判断原理方法的原理、仪器、试剂、具体操作规程、各项性能指标（三）评价试验的书面报告（了解）135（1）若EU＜EA，以95%的可能性接受候选方法。可信区间判第七节实验的诊断性能评价（熟悉）方法的选择方法的评价实验的诊断性能评价方法性能判断方法学评价诊断学评价临床诊断实验室诊断试验的特性、临床诊断价值

136第七节实验的诊断性能评价（熟悉）方法的选一、临床诊断试验的评价标准与指标应用临床流行病学原理和方法对诊断试验进行科学的研究和评价，为临床医师提供各种诊断试验的特性、临床诊断价值。评价过程和目的：137一、临床诊断试验的评价标准与指标应用临床流行病学原（一）金标准与诊断试验定义

诊断试验：指一般临床实验检查方法，费用低、操作简单，对病人无损害，快速等优点。

金标准：通过活检、尸检、外科手术、随访等所作出的决定性诊断，公认最可靠，即确诊试验。138（一）金标准与诊断试验定义金标准：通过活检、尸检、外科手诊断试验和金标准的应用：诊断试验金标准临床上诊断：提供病人患病的可能性金标准诊断试验诊断结果为患者和非患者诊断性试验的性能评价：诊断结果为患者和非患者测得其阴性或阳性结果拿不准进行各种分析139诊断试验和金标准的应用：诊断试验金标准临床上诊断：提供病人患140140（二）诊断试验的常见评价指标1．灵敏度与漏诊率

TP代表真阳性，指金标准确诊为有该病的病例组中经诊断试验检出的阳性例数，将其分别设为分母、分子的比率为灵敏度(Se)，又称为真阳性率（如仅用“阳性率”称呼则不严格）。FN代表假阴性，指金标准确诊为有该病的病例组中经诊断试验检出的阴性例数，将其分别设为分母、分子的比率为假阴性率（漏诊率）。141（二）诊断试验的常见评价指标1．灵敏度与漏诊率141理想的诊断灵敏度为100%。临床上诊断灵敏度越高则漏诊率越低，灵敏度＝1－漏诊率。灵敏度高的诊断试验主要用于：①疾病漏诊可造成严重后果者，通过普查或定期健康体验进行筛选某疾病，以防止漏诊。②拟诊为某疾病时，可起到排除某病的诊断或早期确诊。142理想的诊断灵敏度为100%。临床上诊断灵敏度越高则漏诊率越低2．特异度与误诊率TN代表真阴性，指金标准确诊为无该病的对照组中经诊断试验检出的阴性例数，将其分别设为分母、分子的比率为特异度(Sp)，又称为真阴性率（如仅用“阴性率”称呼则不严格）。FP代表假阳性，指金标准确诊为无该病的对照组中经诊断试验检出的阳性例数，将其分别设为分母、分子的比率为假阳性率（误诊率）。1432．特异度与误诊率143理想的诊断特异度为100%。临床上诊断特异度越高的试验则误诊率越低，特异度＝1－误诊率。特异度高的诊断试验主要用于：①拟诊疾病严重但疗效与预后均不好的疾病，以防误诊，尽早解除病人的压力。②拟诊患有某病的概率较大时，以便确诊。144理想的诊断特异度为100%。临床上诊断特异度越高的试验则误诊3．准确度（accuracy）又称诊断效率，指诊断试验检出的真阳性和真阴性例数之和占全部受检者的百分率。理想的诊断试验准确度应为100%。1453．准确度（accuracy）又称诊断效率，指诊断试验检出4．预测值（predictivevalue，PV）又称预告值，指一项诊断试验能够确定或排除某疾病存在与否的诊断概率（1）阳性预测值(＋PV)由诊断试验检出的全部阳性例数中，真正患病的例数所占的百分率，也称为试验后诊断为患病的可能性。表示确定诊断的概率。（2）阴性预测值（－PV）由诊断试验检出的全部阴性例数中，非患病的例数所占的百分率。表示排除诊断的概率。1464．预测值（predictivevalue，PV）又称预5．流行率（prevalence，P）指被检查的全部对象中由金标准划分的病例人群所占的百分比，也称为试验前诊断为患病的可能性或患病率。1475．流行率（prevalence，P）指被检查的全部对象中二、受试者工作曲线ROC曲线的主要作用：①选择合适的诊断阈值②比较两种不同诊断试验对同种疾病诊断的可靠性。148二、受试者工作曲线ROC曲线的主要作用：148kqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhnsyEKQW$)39flrxCIOU#(17djpvBGMSY&06bhntzFKQW$-4aflrxDJPU#(28ejpvBHNTY&06ciotzFLRX$-4agmsxDJPV!)28ekqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhnsyEKQW$)39flrxCIOU#(17djpvBGMSY&06bhntzFKQW$-4aflrxDJPU#(28ejpvBHNTY&06ciotzFLRX$-4agmsxDJPV!)28ekqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhnsyEKQW$)39flrxCIOU#(17djpvBGMSY&06bhntzFKQW$-4aflrxDJPU#(28ejpvBHNTY&06ciotzFLRX$-4agmsxDJPV!)28ekqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhnsyEKQW$)39flrxCIOU#(17djpvBGMSY&06bhntzFKQW$-4aflrxDJPU#(28ejpvBHNTY&06ciotzFLRX$-4agmsxDJPV!)28ekqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhnsyEKQW$)39flrxCIOU#(17djpvBGMSY&06bhntzFKQW$-4aflrxDJPU#(28ejpvBHNTY&06ciotzFLRX$-4agmsxDJPV!)28ekqwBHNTZ*16ciouAGLRX%+5agmsyEKPV!)39fkqwCIOTZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvBGMSY&06bhntzFLQW$-4aflrxDJPU#(28ekpvBHNTY&06ciotzFLRX%-4agmsxDJPV!)28ekqwCHNTZ*16ciouAGLRX%+5bgmsyEKPV!)39fkqwCIOUZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvBGMSY&06bhntzFLQW$-4aflrxDJPU#(28ekpvBHNTY&06ciotzFLRX%-4agmsxDJPV!)28ekqwCHNTZ*16ciouAGLRX%+5bgmsyEKPV!)39fkqwCIOUZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvBGMSY&06bhntzFLQW$-4aflrxDJPU#(28ekpvBHNTY&06ciotzFLRX%-4agmsxDJPV!)28ekqwCHNTZ*16ciouAGLRX%+5bgmsyEKPV!)39fkqwCIOUZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvBGMSY&06bhntzFLQW$-4aflrxDJPU#(28ekpvBHNTY&06ciotzFLRX%-4agmsxDJPV!)28ekqwCHNTZ*16ciouAGLRX%+5bgmsyEKPV!)39fkqwCIOUZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvBGMSY&06bhntzFLQW$-4aflrxDJPU#(28ekpvBHNTY&06ciotzFLRX%-4agmsxDJPV!)28ekqwCHNTZ*16ciouAGLRX%+5bgmsyEKPV!)39fkqwCIOUZ*17djouAGMSY%+5bhntyEKQW$)39flrxCIOU#(27djpvEKQV!)39flqwCIOUZ*17djpuAGMSY&+5bhntyEKQW$-39flrxDIOU#(27djpvBHMSY&06chntzFLQW$-4aglrxDJPV#(28ekpvBHNTZ&06ciouzFLRX%-4agmsyDJPV!)38ekqwCHNTZ*17ciouAGMRX%+5bgmsyEKQV!)39flqwCIOUZ*17djpuAGMSY&+5bhntyEKQW$-39flrxDIOU#(27djpvBHMSY&06chntzFLQW$-4aglrxDJPV#(28ekpvBHNTZ&06ciouzFLRX%-4agmsyDJPV!)38ekqwCHNTZ*17ciouAGMRX%+5bgmsyEKQV!)39flqwCIOUZ*17djpuAGMSY&+5bhntyEKQW$-39flrxDIOU#(27djpvBHMSY&06chntzFLQW$-4aglrxDJPV#(28ekpvBHNTZ&06ciouzFLRX%-4agmsyDJPV!)38ekqwCHNTZ*17ciouAGMRX%+5bgmsyEKQV!)39flqwCIOUZ*17djpuAGMSY&+5bhntyEKQW$-3