蛋氨酸与半胱氨酸美拉德反应产物分析

蛋氨酸与半胱氨酸美拉德反应产物分析

几千年来，金华火腿是中国人民加工肉品的经验和智慧结晶。它以其色泽、香气、口感和形状闻名于世界各地，深受人们喜爱。风味是金华火腿重要的品质特征,对其独特风味的研究是历年来的研究热点。金华火腿独特的风味成分主要形成于成熟时期。游离氨基酸(FAA)参与的美拉德反应、Strecker降解反应对火腿风味的形成具有重要作用。蛋氨酸和半胱氨酸是金华火腿成熟中期主要的含硫氨基酸。有文献报道,含硫氨基酸和还原糖之间的美拉德反应可以产生似肉的芳香。金华火腿挥发性风味物质中的含硫化合物主要是由含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸经过一系列反应生成,这些含硫化合物的阈值很低,对火腿风味影响较大。以上研究结果只是根据金华火腿中检测出的挥发性含硫化合物推测得出的,但是对于含硫氨基酸美拉德反应产物的具体研究,以及美拉德反应产物在金华火腿挥发性风味物质形成中的作用,目前还未见详细报道。由于在复杂的火腿体系中研究风味成分的来源困难较大,而且一些有关氨基酸与还原糖美拉德反应的研究多是在高温环境条件下进行的,与金华火腿成熟环境差异较大,不能准确地阐明美拉德反应对火腿风味物质的贡献。本实验通过模拟金华火腿成熟环境,采用固相微萃取(SPME)和气相-串联质谱(GC-MS)等一系列技术对金华火腿中主要含硫氨基酸(蛋氨酸、半胱氨酸)美拉德反应挥发性产物进行分析,鉴定出火腿中蛋氨酸、半胱氨酸美拉德反应的挥发性产物,并研究这些挥发性产物对火腿风味的贡献,以期为火腿风味物质形成过程的研究提供一定的基础,更好地指导金华火腿风味的研究。1材料和方法1.1spme萃取装置蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖(均为色谱纯)美国ChemService公司。固相微萃取装置(75�mCAR/PDMS萃取头、SPME专用15mL顶空萃取瓶)、GC-MS装置美国Finnigan公司;DNP-9272型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司。1.2中期蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖的含量以5g金华火腿为样品,根据前期实验检测出的金华火腿成熟中期游离氨基酸的含量,确定5g金华火腿成熟中期蛋氨酸、半胱氨酸、葡萄糖的含量分别为1.208×10-2、1.025×10-3、2.500×10-3g,并根据含量分别配制20mmol/L蛋氨酸、半胱氨酸和葡萄糖溶液,在顶空萃取瓶中确定2个独立反应:蛋氨酸+葡萄糖、半胱氨酸+葡萄糖,置于40℃的恒温培养箱中反应15d后于―40℃冰箱中保存。1.2.1老化2h将固相微萃取头在气相色谱进样口240℃老化2h。萃取头插入样品瓶并推出吸附纤维头,40℃恒温吸附35min,随后插入气相色谱仪进样口240℃解吸5min。1.2.2载气he流速2.2min,ktbk、20kpa恒压kfm、模式1.2参考Gaspardo等的方法并略作改动。色谱条件:DB-WAX毛细管色谱柱(30mm×0.25mm,0.25�m),载气He流速0.3mL/min、不分流、35kPa恒压,进样口和接口温度240℃。升温程序:起始柱温40℃保持2min,5℃/min升至60℃,10℃/min升至100℃,18℃/min升至240℃保留6min,FID检测温度240℃。质谱条件:离子源温度200℃、电离方式EI、电子能量70eV,灯丝电流150�A,扫描质量范围m/z33~450。1.2.3-n-可培养成分检测GC-MS分析图谱经计算机和人工方式把检出的每个峰同时与Meanlib、Replib、Willey、Nistdemo4个图谱库进行比较,相似指数(SI)在800以上者为确定的化合物。化合物定量为按峰面积归一化法计算相对含量。2挥发性风味物质图1为金华火腿成熟中期条件下蛋氨酸美拉德反应挥发性产物的GC-MS图谱。图2为金华火腿成熟中期条件下半胱氨酸美拉德反应挥发性产物的GC-MS图谱。由表1可知,蛋氨酸反应体系共检出23种挥发性产物,主要包括含硫化合物、醇、醛、酮、酸;由表2可知,半胱氨酸反应体系共检出18种挥发性产物,主要包括醛、酮、含氮化合物、含硫化合物。其中3-环丙基-1-丁炔、壬醛、乙酸、4-苯甲酰基-2-氢-吡喃-3-酮、2-乙基-1-己醇、2-羟基-2-(对甲氧苯基)-3-羟基羰基-3-甲基-丁烷、[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮-2-甲氧基苯并噻吩是蛋氨酸、半胱氨酸挥发性产物中的相同物质。在蛋氨酸的23种挥发性产物中,共有10种产物属于金华火腿挥发性风味物质,这10种物质分别是:甲硫醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、三甲基硫代丙醛、乙酸、2-乙基-1-己醇、辛醛、壬醛、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮;半胱氨酸的18种挥发性产物中,共有7种产物属于金华火腿挥发性风味物质。这7种物质分别是:乙酸、2-乙基-1-己醇、己醛、壬醛、丙酮、3-羟基-2-丁酮、苯乙酮。由于含硫氨基酸与葡萄糖的美拉德反应是在模拟金华火腿高温成熟的环境条件下进行的,由GC-MS分析结果可知,高温的环境加剧了火腿中美拉德反应,生成多种挥发性风味物质。其中甲硫醇、乙酸、3-羟基-2-丁酮、2-乙基-1-己醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、己醛是金华火腿重要的挥发性风味物质,这说明金华火腿高温成熟环境条件下的美拉德反应对火腿风味物质的形成具有重要作用。3讨论3.1分离的风味物质从结果可以看出,蛋氨酸是火腿中含硫化合物的主要提供者,甲硫醇、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物是蛋氨酸美拉德反应的特征产物,而且二甲基二硫化物的相对含量高达52.51%。含硫化合物由于其较低的风味阈值而成为肉品风味的重要因素,二甲基二硫化物和二甲基三硫化物更被认为是金华火腿的主体风味成分。Flores等也曾提出,干腌火腿中的含硫化合物主要是通过含硫氨基酸降解产生,如蛋氨酸降解可产生甲硫醇,甲硫醇氧化可生成二甲基二硫化物,进一步反应可生成二甲基三硫化物和二甲基硫化物,三甲基硫代丙醛可能来自于美拉德反应的分支氨基酸Strecker降解,二甲基二硫化物来自三甲基硫代丙醛的分解。通过蛋氨酸和半胱氨酸美拉德反应产物分析可以看出,金华火腿中含硫挥发性风味物质主要由蛋氨酸提供。这可能是因为金华火腿成熟中期的半胱氨酸含量非常低,仅为蛋氨酸10%的缘故。3.2支链氨基酸streger降解半胱氨酸类化合物蛋氨酸美拉德反应产物中的醇类物质为三甲基硫代丙醇、4-甲基-3-戊烯-1-醇、4-乙炔基-4-甲基-1,5-己二烯-3-醇、2-乙基-1-己醇,其中2-乙基-1-己醇在半胱氨酸的产物中也有检测到。支链氨基酸Strecker降解可以产生支链羰基化合物和醇,如三甲基硫代丙醇、2-乙基-1-己醇。虽然醇类物质的含量很高,但由于醇的风味阈值与其他羰基化合物相比较高,所以其风味在肉品中被认为是不重要的,但其可以作为风味前体物质参与后期的反应。3.3ecker反应蛋氨酸美拉德反应产物中的醛类物质为辛醛、壬醛和苯甲醛;半胱氨酸美拉德反应产物醛类物质为己醛和壬醛。醛类物质主要是由氨基酸的Strecker降解反应产生。醛类物质由于阈值很低,对火腿风味具有较大的贡献。己醛、辛醛和壬醛不仅是金华火腿重要的风味物质,还可以增加Serrano火腿的清香气味,与Iberian火腿的风味也密切相关。苯甲醛在Corsican火腿中也有发现。章建浩等研究发现在金华火腿成熟过程中醛类物质的总体相对比例逐渐降低,表明醛也是火腿成熟过程的中间产物,同时可能转变为羧酸等其他挥发性成分。3.4糖原内化信息中的化合物从结果可以看出,半胱氨酸美拉德反应主要产物为酮类物质,这可能来自于氨基酸或者是糖类物质的降解,如丙酮、3-羟基-2-丁酮可能来自糖原的降解,3-羟基-2-丁酮也可以转化为2,3-丁二酮。丙酮在酮类物质中所占比重较大,这与火腿挥发性风味物质中丙酮在酮类物质中所占比重较一致。蛋氨酸反应产物中的6-甲基-5-庚烯-2-酮已在金华火腿中直接检测到。3.5氨基酸美拉德反应2-乙基己酸和乙酸分别是蛋氨酸和半胱氨酸的反应产物,在火腿中羧酸类物质可能来自氨基酸美拉德反应中的脱氨反应,也可能是醛类和酮类等物质转变而来。刘登勇等认为由于乙酸的风味阈值太高,故其对火腿整体的风味贡献非常小。但章建浩等认为金华火腿高温成熟环境使羧酸显著增加,也是金华火腿具有独特风味的原因。3.6美拉德反应中杂环化合物的生成蛋氨酸和半胱氨酸的反应产物中有大量的杂环类物质,这可能是由于美拉德反应过程复杂,反应过程中产生许多中间产物。曾有学者提出,美拉德反应产生的产物中含有大量的杂环化合物,包括呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、噻唑等,[2,3-c]喹啉-6(5H)-酮-2-甲氧基苯并噻吩、2-甲基四氢噻吩-3-酮、4-苯甲酰基-2-氢-吡喃-3-酮、N-乙基-1,3-二硫代异吲哚啉、双环3,5,5-三甲基环己烯-2-烯酮等生成的杂环类物质可能会作为反应的中间产物,参与更多的反应。4发性风味物质结果表明,在金华火腿成熟中期的环境条件下,蛋氨酸、半胱氨