uplc串联质谱法测定11种磺胺类化合物

uplc串联质谱法测定11种磺胺类化合物

磺胺类药物可以抑制大多数革兰氏阳性和阴性菌以及某些革兰氏阴性菌。它可以预防和治疗食物中的动物疾病，如防止和治疗食物中的细菌、以便避免、伤寒、白便、球虫病、传染性胃炎和其他疾病。在水产养殖中，它可以用于控制肠排便和伤口的形成。此外,磺胺类药物还用作饲料添加剂,促进动物生长,提高动物抗病能力,提高畜禽产量,通过食物链人食用后对人体产生耐药性,机体免疫力下降等副作用。欧盟、美国及我国鲜、冻禽产品国家标准(GB16869-2000)规定磺胺类化合物≦0.1mg/kg,随着家禽养殖业产业化不断扩大,添加药物的不规范的增加,必须有相应的简便易行的技术方法进行日常监控。现行的磺胺类抗生素的检测方法主要有:分光光度法、电化学法、薄层扫描、酶联免疫、放射免疫和HPLC法,液质联用已成为当下复杂基质下同时定量和定性测定多种药残的强有力的工具。超高效液相色谱质谱联用不仅能大大缩短分析时间,提高分析效率,大大提高灵敏度和减少了溶剂消耗且能同时定性和定量。本文建立了利用反相与阳离子交换的混和机制,采用WatersOasisMCX固相萃取小柱同超高效液相质谱联用,同时检测中11种磺胺类化合物残留(即磺胺、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯达嗪、磺胺二甲异恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉)的方法,效果令人满意。1.1电喷雾质谱条件WatersAcquityUltraPerformanceLC超高效液相色谱仪,WatersXevo三重四级杆串联质谱仪,配有电喷雾离子源(ESI)和Masslynx4.1质谱数据系统(美国Waters公司);AE260电子天平(瑞士MettlerToledo公司产品);ASPECXli全自动固相萃取仪(美国吉尔森公司)和ALLTECH手动固相萃取仪(美国Agilent公司);高速离心机(美国Sigma公司);涡旋仪(美国VORTEX);组织匀浆机(国产);真空泵(国产);吹氮仪(国产)1.2磺胺类化合物11种磺胺类标准品:磺胺(sulfanilamide)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺多辛(sulfadoxine)、磺胺甲二唑(sulfamethizol)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺氯达嗪(sulfachloropyridazine)、磺胺二甲异恶唑(sulfisoxazole)、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺喹恶啉(sulfachinoxaline)(Dr.Ehrenstorfer公司,纯度均大于95%),超纯水(Millipore纯水机制),乙腈(色谱纯,美国Merck公司),乙酸(色谱纯,美国Sigma公司),乙酸铵(AR,国产),氨水(AR,国产),WatersOasisMCX(3cc,60mg)固相萃取小柱,0.20μm的过滤膜。磺胺类化合物标准储备液(100mg/L):准确称取0.0100g磺胺类标准品,用乙腈溶解并定容至100ml的棕色容量瓶中,-18℃冷冻保存。磺胺类化合物混标调谐液浓度(1mg/L):分别吸取1ml各种标准贮备液置于100ml棕色容量瓶中,加乙腈定容至刻度,摇匀,保存在4℃冰箱中。标准工作液(2μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L,200μg/L):分别在1.0ml,1.0ml,1.0ml,0.9ml,0.8ml空白样品基质加入2μl,10μl,50μl,100μl,200μl标准储备液(1mg/L)配成不同浓度系列的混和标准工作溶液,用0.2%乙酸水溶液-乙腈(20∶80v/v)定容(临用时配制)。1.3进样量、柱温色谱柱:WatersAcquityUPLCTMBEHC18柱(1.7μm,2.1mm×50mm);流动相:0.2%乙酸水溶液∶乙腈=80∶20,流速:0.3ml/min,进样量:10μl。柱温:40℃。(1)UPLC-MS/MS的质谱条件电离方式:电喷雾电离(ESI);毛细管电压:3.0KV;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂气流量(氮气):700L/h;碰撞气流量(氩气):0.18L/h;锥孔气流(氮气):50L/h。扫描方式:正离子扫描;监测模式:多反应监测(MRM)模式,各种磺胺的采集参数见表1。1.4样品的制备1.4.1样品提取2.1提取剂为有机溶剂由于磺胺类药物难溶于水,较易溶于稀酸、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷等等有机溶剂。由于直接用乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等提取液脂肪含量较高,不利于净化处理,提取效率较低,所以选择乙腈为提取剂。磺胺类药物属弱碱性物质,因此选择混和型阳离子交换的MCX固相萃取小柱,且洗脱液选择碱性乙腈溶液较乙腈更易洗脱。2.2色谱检测条件磺胺类化合物结构中带有氨基,呈弱碱性,在流动相中加入一定比例的酸性溶液,磺胺类化合物在流动相中呈离子形式存在,离子化效率提升。蠕动泵进样时在正离子模式下进行母离子全扫描,确定各种磺胺药物的准分子离子,然后以准分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描,获得二级质谱响应较强的子离子,最后以多反应监测模式进行采集。磺胺类药物在ESI(+)电离模式下,[M+H]+的准分子离子峰,经离子源离子化后,断裂成多个特征离子,由表1可见有m/z92、m/z108、m/z113、m/z156、m/z185等。[M+H]+的准分子离子断裂形成[M-R2NH2]+、[M-R2NH2-SO]+、[M-R2NH2-SO2]+、[R2NH3]+、[M+H-H2SO2]+、[R2NHSO2]+等碎片离子。由于同时监测的离子数较多有24个,本研究选择的色谱峰采集点为15个,驻留时间为0.04s,否则会造成峰型不尖,峰型较差。定性与定量该方法定性满足4个条件:1.空白试验无干扰离子峰;2.特征离子色谱峰信噪比(S/N)都在3;1以上;3.试样色谱峰保留时问应与校正溶液一致,容许偏差为±2.5%;4.检测到的离子丰度比应与校正溶液一致,容许偏差达到欧盟2002/657/EC中的规定。定量时以响应强度最强离子对进行计算。2.3方法的线性范围在空白牛肉样品基质分别加入2μl,10μl,50μl,100μl,200μl标准储备液(1mg/L)配成(2μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L,200μg/L)不同浓度系列的混和标准工作溶液,用0.2%乙酸水溶液-乙腈(20∶80v/v)定容(现用现配),进样10μl进行UPLC-MS/MS分析,以测得峰面积对浓度作校正曲线,相关线性系数均大于0.998,表明在2μg/L~200μg/L浓度范围呈线性关系,符合定量要求。2.4准确度与精密度以S/N>10为定量检测下限,乘以方法的浓缩倍数为方法定量检测下限,各化合物数值见表2;在空白牛肉样品中添加浓度为5μg/kg,20μg/kg,100μg/kg的11种磺胺类化合物标准溶液,方法回收率在68.3%~108%范围。空白加标样品经前处理后上样,连续7次进样进行精密度试验,相对偏差均小于10%,满足实验要求。内脏、蛋、奶等的回收率也符合要求。2.5磺胺类药残此UPLC-MS/MS检测器在2.5min之内完成了测定11种磺胺类药残,较PDA检测器有更低的检出限和抗干扰能力,前处理操作快速简单,可重复性好,可满足国内外对动物源性食品中磺胺类化合物的快速、准确的检测要求,适合大量样品的筛查、准确定量和定性分析。1材料和方法2提取液的制备将组织充分绞碎混均后,取5.00g样品于50ml离心管中,用移液器加入20ml乙腈,均质器均质3min,5000r/min离心5min,将上层转移至离心管中,残渣再用10ml乙腈重复提取1次