生药学-第四章-生药的安全性评价课件

第四章

生药的安全性评价第四章

生药的安全性评价

药物的最基本要求：安全。影响生药安全性的主要因素：（1）生药含有的内源性次生代谢产物（2）外源性物质：如重金属和有害元素、农药残留、二氧化硫、黄曲霉素等。药物的最基本要求：安全。本章内容生药中内源性有害物质的检测1生药中重金属和有害元素的检测2生药中农药残留的检测3生药中其他有害物质的检测4本章内容生药中内源性有害物质的检测1生药中重金属和有害元第一节生药中内源性有害物质的检测

一、生药内源性有害物质（endogenousharmfulsubstances）

生药内源性有害物质主要包括肝毒性成分和肾毒性成分等。第一节生药中内源性有害物质的检测一、生药内源性有害物质（

1、肝毒性成分

吡咯里西啶生物碱(heptotoxicpyrro1izidinealkaloids，HPAs)是目前已知的最重要的植物来源的肝毒性成分，其共同的结构特征是1,2位具双键的不饱和necine酯，如野百合碱(monocrotaline)和千里光碱(senecionine)。1、肝毒性成分千里光碱野百合碱千里光碱野百合碱

这类生物碱本身没有毒性，毒性来自其在体内(主要是肝脏)的代谢产物—代谢吡咯(metabo1icpyrro1es)代谢吡咯具很强的亲电性，能迅速地同有关的酶、蛋白、DNA及RNA结合，引起各种毒性反应。

由于吡咯里西啶生物碱（HPAs）在肝脏脱氢后形成的代谢产物非常活泼，故肝脏既是代谢吡咯的形成场所，又是其毒性的靶器官这类生物碱本身没有毒性，毒性来自其在体摄入HPAs引起的主要病变是肝小静脉阻塞性疾病(HVOD)，表现为急性肝炎、严重腹痛、呕吐、腹泻、腹水、肝肿大、黄疸、水肿。慢性HVOD可表现为轻度恶心、厌食、疲劳或肝肿大。如不治疗，可发展为肝硬变和坏死。除了亚急性HVOD外，其余情况下总是表现为血清肝酶水平升高。摄入HPAs引起的主要病变是肝小静脉

流行病学调查显示：在南非、阿富汗、伊朗、牙买加、印度及前苏联等国家，大量肝病的发生与食用含HPAs的谷物、饮用含HPAs的饮料(牛奶、茶叶等)及服用含HPAs的草药有关。因服用含HPAs的草药而引起中毒死亡的现象时有报道，从而引起国际医药学界的关注。流行病学调查显示：在南非、阿富汗、伊朗、

世界上约有3%的有花植物（6000余种）含有HPAs，其中95%以上集中于以下科属，即菊科的千里光属、橐吾属、泽兰属、菊三七属和蜂斗菜属，紫草科所有属，豆科猪屎豆属，兰科羊耳蒜属。其它少量分布于厚壳科、玄参科、夹竹桃科、毛茛科、百合科等。初步统计显示含HPAs的中草药共38种，其中临床常用或较常用的有12种，如农吉利、猪屎豆、千里光、款冬、佩兰等。此外，民间使用的一些山紫菀类药材，如大黄橐吾、宽舌橐吾、齿叶橐吾等，其根及根茎中HPAs含量很高，毒性很大。世界上约有3%的有花植物（6000余种）农吉利猪屎豆农吉利猪屎豆千里光千里光款冬佩兰款冬佩兰大黄橐吾

大黄橐吾

2、肾毒性成分

马兜铃酸（aristolochicacid，AA）类化合物在结构上属于3,4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生物，普遍存在于马兜铃科植物中，包括马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ、III、IV等。AristolochicacidIR=OCH3AristolochicacidIIR=H2、肾毒性成分AristolochicacidI

含马兜铃酸的中草药可引起肾损害。1993年，比利时学者报道了一些长期服用含广防己减肥药的年轻女性发生慢性肾衰竭，这种肾衰竭表现为肾脏进行性快速纤维化并伴有肾萎缩，国外称为“中草药肾病”（Chineseherbsnephropathy，CHN）。国内学者依据其毒性成分为马兜铃酸，建议将其称为“马兜铃酸肾病”（aristolochicacidnephropathy，ANN）。含马兜铃酸的中草药可引起肾损害。199

世界上大约有200多种马兜铃属植物，其中作为药用的有20多种。我国应用较多的马兜铃属药材有马兜铃（北马兜铃或马兜铃的果实）、青木香（北马兜铃或马兜铃的根）、天仙藤（北马兜铃或马兜铃的地上部分）、关木通（东北马兜铃的藤茎）、寻骨风（绵毛马兜铃的全草）、广防己（广防己的根）和朱砂莲（朱砂莲的根茎）等。马兜铃青木香世界上大约有200多种马兜铃属植物，其关木通寻骨风广防己关木通寻骨风广防己3、生药中的其他毒性成分

生药中内源性有毒成分还包括一些其他的结构类型。如毛茛科乌头属植物所含乌头碱对中枢神经表现出先兴奋后抑制作用，可致呼吸中枢麻痹及中枢性血压下降，对心脏的损害则表现为心悸、胸闷、血压下降、心律失常、心率减慢或过速，甚至可能发生心跳骤停、急性心源性脑缺血综合征等。乌头3、生药中的其他毒性成分乌头

夹竹桃科、萝藦科植物所含强心苷类成分则较易产生心脏毒性；茄科植物所含莨宕烷类生物碱为M-胆碱受体阻滞剂，中毒时可抑制呼吸中枢；夹竹桃颠茄夹竹桃科、萝藦科植物所含强心苷类成分则较

马钱子所含吲哚类生物碱如士的宁对中枢神经表现出先兴奋后抑制作用；苦杏仁、桃仁等所含苦杏仁苷经酶解后可释放出剧毒的氢氰酸；苍耳子、蓖麻子所含毒蛋白可致严重的肝、肾损害等。马钱子苍耳马钱子所含吲哚类生物碱如士的宁对中枢神经

二、生药中主要的内源性有害物质的检测

方法举例

生药中吡咯里西啶生物碱和马兜铃酸常用的检测方法是高效液相色谱法、高效毛细管电泳及其与质谱的联用技术。二、生药中主要的内源性有害物质的检测

色谱-质谱条件：色谱柱：WatersXBridgeTMC18色谱柱(2.1×100mm，3.5μm)；流动相：乙腈-0.5%甲酸（7∶93）；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量2µl；质谱检测器，ESI正离子模式下选择m/z366.4离子进行检测；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：55V；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：400℃；锥孔气流速：50L/h；脱溶剂气流速：400L/h。

千里光中阿多尼弗林碱高效液相色谱-质谱分析色谱-质谱条件：色谱柱：WatersXBridge12A-1A-2B-1B-212A.对照品；B.样品；1.野百合碱；2.阿多尼弗林碱12A-1A-2B-1B-212A.对照品；B.样品；1三、生药中主要的内源性有害物质限量

生药中的内源性有害物质可分为两种情况：（1）仅是有毒成分但不是有效成分，如苍耳子中的苍术苷、千里光中的吡咯里西啶类生物碱等；（2）既是有毒成分又是有效成分，即以其毒性来治疗疾病，如附子中的乌头碱，马钱子中的士的宁等。为了保证临床用药安全有效，需要对生药中内源性有害物质规定限量。三、生药中主要的内源性有害物质限量生药中的内源性有害物

对于第一种情况，需要规定含量限量或服用限量（上限）

WHO专门制订了关于HPAs的健康及安全指南，认为致肝小静脉闭塞病的每日最高摄入量为0.015mg/kg，即相当于70kg体重成人每天最高摄入量不得超过1mg；

德国卫生部规定，内服含HPAs的植物药制剂，每天摄取量不得超过1

g，外用时每天用量不得超过100

g。

《中国药典》（2010年版）规定千里光含阿多尼弗林碱（adonifoline）不得超过0.004%，药材的每天最大用量不得超过30g。对于第一种情况，需要规定含量限量或对于第二种情况，则应规定含量幅度（上、下限）

《中国药典》（2010年版）规定川乌含乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的总量应为0.050%~0.17%，马钱子含士的宁应为1.20%~2.20%。对于第二种情况，则应规定含量幅度（上、下限）第二节生药中重金属和有害元素的检测

生药中一类重要的外源性有害物质（exogenousharmfulsubstances）就是重金属及有害元素。常见对人体有害的元素和重金属元素主要有砷、汞、铅、镉、铜、铝等。

来源：（1）与植物生长的环境条件如土壤、大气、水、化肥、农药的施用等有关（2）与植物本身的遗传特性和对该类元素的富集能力等有关。第二节生药中重金属和有害元素的检测1.生药中重金属和有害元素的检测方法

重金属总量常用硫代乙酰胺或硫化钠显色反应比色法测定。有害元素砷常用古蔡法或二乙基二硫代氨基甲酸银法测定。单个重金属和有害元素测定方法有原子吸收光谱法和电感耦合等离子体质谱法。《中国药典》（2010年版）附录已对这些测定方法进行了规范。1.生药中重金属和有害元素的检测方法重

原子吸收分光光度法(atomicabsorptionspectrophotometry,AAS)的测定对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素，如铅、镉、砷、汞、铜等，系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，通过测定辐射光强度减弱的程度，求出供试品中待测元素的含量。原子吸收一般遵循分光光度法的吸收定律，通常通过比较标准品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测元素的含量。原子吸收分光光度法(atomicabs

电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasma-massspectrometry,ICP-MS)是将被测物质用电感耦合等离子体离子化后，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度的一种分析方法。等离子体是由自由电子、离子和中性原子或分子组成，总体上成电中性的气体，其内部温度高达几千度至一万度。样品由雾化器雾化后由载气携带从等离子体焰炬中央穿过，迅速被蒸发电离并通过离子引出接口或采样锥导入到质量分析器，样品在极高温度下完全蒸发和解离，电离的百分比高，因此几乎对所有元素均有较高的检测灵敏度。电感耦合等离子体质谱法(inducti2.生药中常见重金属和有害元素的限量

《中国药典》（2010年版）共对18种药材、18种植物油脂和提取物提出重金属或有害物质的限量要求。

中国商务部于2005年发布了《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（WM/T2-2004），规定药用植物及制剂的绿色品质标准，包括药用植物原料、饮片、提取物及其制剂等的重金属及砷盐限量：重金属总量≤20.0

mg/kg，铅≤5.0mg/kg，镉≤0.3mg/kg，汞≤0.2mg/kg，铜≤20.0mg/kg，砷≤2.0mg/kg。

2.生药中常见重金属和有害元素的限量《中中药材重金属总量铅镉砷汞铜山楂50.320.220丹参50.320.220甘草50.320.220白芍50.320.220白矾20玄明粉2020地龙30芒硝1010西瓜霜1010西洋参50.320.220冰片52龟甲胶30阿胶50.320.220金银花50.320.220枸杞子50.320.220黄芪50.320.220鹿角胶302滑石粉402《中国药典》（2010年版）中药材重金属或有害元素的限量（ppm）

中药材重金属总量铅镉砷汞铜山楂50.320.220丹参50.《中国药典》（2010年版）植物油脂和提取物重金属或有害元素的限量（ppm）

植物油脂和提取物重金属总量铅镉砷汞铜丁香罗勒油10八角茴香油5人参茎叶总皂苷20.220.220人参总皂苷30.220.220三七三醇皂苷20三七总皂苷50.320.220丹参总酚酸提取物10丹参酮提取物10灯盏花素50.320.2连翘提取物202牡荆油10茵陈提取物50.320.220莪术油102桉油10积雪草总苷50.320.220黄芩提取物20银杏叶提取物20薄荷脑50.320.220《中国药典》（2010年版）植物油脂和提取物重金属或有害元素）

组织、国家或地区适用对象重金属总量铅汞砷镉铜铬WHO草药产品100.3美国膳食补充剂（mg/day）0.0060.02加拿大草药材100.250.32草药产品（mg/day）0.020.020.010.0060.02膳食补充剂原料1050.30.2德国草药50.10.2日本药材502韩国草药3050.230.3泰国草药材和成品1040.3马来西亚草药成品100.55新加坡中成药200.55150中国台湾中药材3022中国香港中药材（8种）50.220.3中国澳门外用中药200.55150国际组织、国家或地区对中草药及其制品重金属或有害元素的限量（ppm）组织、国家或地区适用对象重金属总量铅汞砷镉铜铬WHO草药第三节生药中农药残留的检测

生药中另一类重要的外源性有害物质就是农药残留(pesticideresidues)。生药中常见的农药残留包括有机氯化合物、有机磷化合物和拟除虫菊酯类等。生药的种植、采收、包装运输、贮藏等各个环节都有可能和农药接触，被其污染。第三节生药中农药残留的检测生药中另一1.生药中农药残留的检测方法

农药残留的检测方法主要是气相色谱法。1.生药中农药残留的检测方法

《中国药典》（2010年版）规范了农药残留量的气相色谱测定法，包括有机氯类农药残留量测定、有机磷农药残留量测定和拟除虫菊酯类农药残留量测定。

此外，生药中农药残留量的测定还有气相色谱-质谱联用法、柱后衍生高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等方法。《中国药典》（2010年版）规范了农药残留量的有机氯农药残留的测定

毛细管气相色谱法测定菊花中18种有机氯类农药残留量：

色谱条件：DB-1701石英毛细管柱（30m×0.32mm，0.25

m）；载气为高纯氮；进样量1ml；进样口温度210℃；程序升温：初始温度120℃，保持2分钟，以每分钟8℃升至180℃，保持4分钟，再以每分钟8℃升至225℃，以每分钟10℃升至270℃，保持10分钟；63Ni-ECD电子捕获检测器；检测器温度300℃。有机氯农药残留的测定

毛细管气相色谱法测定菊花中18种有机氯

对照品：四氯硝基苯（1）、六氯苯（2）、α-BHC（3），β-BHC（9），γ-BHC（5），δ-BHC（10）、五氯硝基苯（4）、七氯（6）、艾氏剂（7）、甲基五氯苯基硫醚（8）、环氧七氯（11）、α-硫丹（12）、反式氯丹（13）、顺式氯丹（14）、p,p′-DDE（15），o,p′-DDT（16）,p,p′-DDD（17）,p,p′-DDT（18）。

t/minAt/minB2A.对照品;B.样品t/minAt/minB2A.对照品;B.样品有机磷农药残留测定中药材中25种有机磷类农药的定性及定量分析：

GC-FPD定量分析：DB-5毛细管柱（30m×0.32mm，0.25

m）；火焰光度检测器FPD；载气为高纯氦气，流速1mL/min；进样量2mL，分流进样，分流比5∶1；进样口温度290℃；程序升温：初始温度100℃，以每分钟10℃升至190℃，保持5分钟，再以每分钟2℃升至220℃，保持5分钟，以每分钟20℃升至300℃，保持5分钟；检测器温度300℃；氢气流量80mL/min；空气流量120mL/min。有机磷农药残留测定中药材中25种有机磷类农药的定性及定量分析

对照品：久效磷（1）、乐果（2）、特丁磷（3）、二嗪磷（4）、乙拌磷（5）、异稻瘟净（6）、除线磷（7）、皮蝇磷（8）、杀螟硫磷（9）、倍硫磷（10）、对硫磷（11）、毒壤磷（12）、溴硫磷（13）、嘧啶磷（14）、甲基异柳磷（15）、异柳磷（16）、稻丰散（17）、杀扑磷（18）、灭菌磷（19）、丙溴磷（20）、三唑磷（21）、敌瘟磷（22）、达嗪硫磷（23）、溴苯磷（24）、蝇毒磷（25）。对照品：久效磷（1）、乐果（2）、特丁磷生药学-第四章-生药的安全性评价课件拟除虫菊酯类

固相萃取气相色谱内标法测定桔梗中拟除虫菊酯类农药残留量

：

色谱条件：SE-54毛细管柱（30m×0.32mm，0.25

m）；载气为高纯氮，流速1mL/min；不分流进样，进样量1mL；进样口温度200℃；程序升温：初始温度150℃，以每分钟7℃升至270℃，保持20分钟；63Ni-ECD电子捕获检测器，检测器温度300℃。对照品：6-羟基-7-甲氧基香豆素（内标物，1）、联苯菊酯（2）、甲氰菊酯（3）、氯氟氰菊酯（4）、氯菊酯（5,6）、氰戊菊酯（7,8）、溴氰菊酯（9）。拟除虫菊酯类固相萃取气相色谱内标法测定桔梗中拟除虫菊酯类农BAA.对照品;B.样品加标

BAA.对照品;B.样品加标2.生药中农药残留的限量

（1）国内生药中农药残留的限量标准：《中国药典》（2010年版）中对甘草、黄芪、人参茎叶总皂苷、人参总皂苷提出了农药残留限量的要求。甘草黄芪人参2.生药中农药残留的限量（1）国内生药中农药药材六六六（总BHC）滴滴涕(总DDT)五氯硝基苯（PCNB）甘草221黄芪221人参茎叶总皂苷1101人参总皂苷1101《中国药典》（2010年版）对中药材及提取物中有机氯农药残留的限量（mg/kg）：药材六六六（总BHC）滴滴涕(总DDT)五氯硝基苯（PCNB

中国商务部于2005年发布了《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（WM/T2-2004）规定药用植物及制剂的绿色品质标准，包括药用植物原料、饮片、提取物及其制剂等的农药残留量为：六六六(BHC)≤0.1mg/kg，滴滴涕（DDT）≤0.1mg/kg，五氯硝基苯(PCNB)≤0.1mg/kg，艾氏剂(aldrin)≤0.02mg/kg。中国商务部于2005年发布了《药用植物及制剂（2）国外生药中残留农药的限量标准:

许多国家的药典中都有对生药农药残留限度的规定，如《英国药典》（2002年版）规定的植物药农药残留限量（mg/kg）。

（2）国外生药中残留农药的限量标准:《英国药典》2002年版规定的植物药农药残留限量（mg/kg）农药种类限量农药种类限量甲草胺(alachlor)0.02杀螟松(fenitrothion)0.5艾氏剂(aldrin)和狄氏剂(dieldrin)总量0.05氰戊菊酸(fenvalerate)1.5甲基谷硫磷(azinphos-methyl)1.0地虫磷(fonofos)0.05溴螨酯(bromopropylate)3.0七氯(heptachlor)(七氯和环氧七氯的总量)0.05氯丹(chlordane)（顺式和反式异构体及氧氯丹的总量）0.05六氯苯(hexachlorobenzene)0.1毒虫畏(chlorfenvinphos)0.5六六六(hexachlorocyclohexane)(异构体(除γ体之外)0.3毒死蜱(chlorpyrifos)0.2林丹(lindane)(γ—六六六)0.6甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)0.1马拉硫磷(malathion)1.0氯氰菊酯(cypermethrin)(及异构体)1.0杀扑磷(methidathion)0.2滴滴涕(DDT)(p,p′—DDT、o,p′—DDT、p,p′—DDE及p,p′—TDE的总量)1.0对硫磷(parathion)0.5溴氰菊酸(deltamethrin)0.5甲基对硫磷(parathion-methyl)0.2二嗪农(diazinon)0.5苄氯菊酯(permethrin)1.0敌敌畏(dichlorcvos)1.0伏杀磷(phosalone)0.1《英国药典》2002年版规定的植物药农药残留限量（mg/第四节生药中其他有害物质的检测生药中常见的其他有害物质

：

黄曲霉素与二氧化硫。

第四节生药中其他有害物质的检测1.黄曲霉素：

黄曲霉素（Aflatoxin，AF）是由黄曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）产生的一类代谢产物。目前已分离鉴定出12种以上，分为AFB1与AFG1两大类，其基本结构都是二呋喃香豆素衍生物。在天然污染的食品中以AFB1最为多见，且毒性和致癌性也最强。故在食品监测中常以AFB1作为污染指标。1.黄曲霉素：

中药材污染黄曲霉素主要与药材品种、产地有关，如薏米、益智仁、柏子仁等含油性大、易霉变的药材容易受到污染，食品中以花生、玉米、大米、棉籽最容易受到污染；其次与工艺剂型有关，如豆豉、曲类需发酵，极易发生霉变；再次，由于对药材未进行及时处理，没有及时晒干或者贮存不当，而产生霉变，尤其是在炎热潮湿的地区。中药材污染黄曲霉素主要与药材品种、产地有关，如薏

黄曲霉素（AF）易溶于三氯甲烷和甲醇而不溶于正己烷、石油醚与乙醚。在长波紫外光下，AFB1和AFB2产生蓝紫色荧光；AFG1和AFG2产生黄绿色荧光。AF纯品为无色结晶，耐高温，AFB1的分解温度为268℃。如在带水条件下加温可破坏部分毒素。AFB1AFB2AFG1AFG2黄曲霉素（AF）易溶于三氯甲烷和甲醇而不溶于黄曲霉素检测方法：

黄曲霉素最容易存在于花生、玉米、大米、植物油脂等常见的食品中，是这些农产品的常规检测项目，在实际检验工作中我国颁布了一系列黄曲霉素检测方法的国家标准。黄曲霉素检测方法：如：采用薄层色谱法或间接竞争性酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）测定食品中黄曲霉素B1（GB/T5009.22-2003），采用免疫亲和层析净化-高效液相色谱法和免疫亲或层析净化-荧光光度法测定食品中黄曲霉毒（GB/T18979-2003）。《中国药典》（2010年版）规范了药材、饮片及制剂中黄曲霉素的高效液相色谱测定法。如：采用薄层色谱法或间接竞争性酶联免疫吸附法（enzyme-实例高效液相色谱法测定酸枣仁中黄曲霉素含量

：

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（27：18：55）为流动相，流速0.8ml/min；采用柱后衍生法检测，衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速0.3ml/min，衍生化反应温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长lex=360nm，发射波长lem=450nm。

实例

混合对照品溶液的制备：精密量取黄曲霉素混合标准品（黄曲霉素B1、黄曲霉素B2、黄曲霉素G1、黄曲霉素G2标示