第二节 基因工程的基本操作程序

第二节基因工程的基本操作程序第1页，课件共42页，创作于2023年2月知识点一：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的DNA序列。没有启动子，基因就不能转录。RNA聚合酶:能够识别启动子并与其结合的一种蛋白质,催化RNA的合成。终止子：位于基因的尾端的一段DNA序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。注意：与起始密码、终止密码的区别第2页，课件共42页，创作于2023年2月①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子注意：与起始密码、终止密码的区别,密码子是位于mRNA上的三个相邻的核糖核苷酸。第3页，课件共42页，创作于2023年2月编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合内含子外显子能够编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：知识点二：真核细胞的基因结构第4页，课件共42页，创作于2023年2月真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点等。非编码序列原核基因:非编码区真核基因:非编码区+内含子注意：第5页，课件共42页，创作于2023年2月原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第6页，课件共42页，创作于2023年2月1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体只有进入受体细胞并维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。第7页，课件共42页，创作于2023年2月一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是_________________编码蛋白质的基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成第8页，课件共42页，创作于2023年2月一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：概念见P92.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：根据目的基因的有关信息。第9页，课件共42页，创作于2023年2月提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一直接分离法第10页，课件共42页，创作于2023年2月某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之二第11页，课件共42页，创作于2023年2月基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)比较第12页，课件共42页，创作于2023年2月概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术多聚酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA双链复制2、利用PCR技术扩增目的基因第13页，课件共42页，创作于2023年2月四种脱氧核苷酸一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

条件：与目的基因的起始段互补的DNA片段一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）结果：指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增能量第14页，课件共42页，创作于2023年2月过程：变性、复性、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA复性：冷却至55～60℃引物与单链DNA模板的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性复性延伸第15页，课件共42页，创作于2023年2月2、具体过程第16页，课件共42页，创作于2023年2月PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第17页，课件共42页，创作于2023年2月目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：

3、人工合成的目的基因2）化学合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可用DNA合成仪直接合成。（不要模板，不要DNA聚合酶）第18页，课件共42页，创作于2023年2月二、基因表达载体的构建

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。回顾：作为基因工程的载体必需满足哪些条件呢？第19页，课件共42页，创作于2023年2月2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第20页，课件共42页，创作于2023年2月启动子：位于基因的首端的一段DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段DNA片段，终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第21页，课件共42页，创作于2023年2月①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②启动子、终止子对于目的基因表达必不可少③目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意：第22页，课件共42页，创作于2023年2月三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第23页，课件共42页，创作于2023年2月1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞内，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第24页，课件共42页，创作于2023年2月③过程：转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌第25页，课件共42页，创作于2023年2月（2）基因枪法（3）花粉管通道法第26页，课件共42页，创作于2023年2月2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵细胞受精受精卵显微注射新性状动物第27页，课件共42页，创作于2023年2月3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：

用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子第28页，课件共42页，创作于2023年2月四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功第29页，课件共42页，创作于2023年2月（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子间的杂交（2）过程:第30页，课件共42页，创作于2023年2月2、检测目的基因是否转录出了mRNA①方法:DNA和RNA分子之间的杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第31页，课件共42页，创作于2023年2月（二）、鉴定（个体生物学水平）3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:抗原抗体杂交过程：将目的基因表达出的蛋白质注射进某种动物体内，这种蛋白质对于这种动物而言，是一种非已成分，免疫系统就会进行攻击，从而产生相应的抗体，抗体就会和这种蛋白质进行特异性结合。若转基因生物翻译出了这种蛋白质，就能和相应的抗体进行抗原—抗体杂交，从而出现杂交带。第32页，课件共42页，创作于2023年2月四、目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（DNA-RNA分子杂交）抗原抗体杂交第33页，课件共42页，创作于2023年2月归纳:基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：第34页，课件共42页，创作于2023年2月1）以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习第35页，课件共42页，创作于2023年2月2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是

A、能复制（）

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD练习第36页，课件共42页，创作于2023年2月3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习第37页，课件共42页，创作于2023年2月4）有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为运载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习第38页，课件共42页，创作于2023年2月5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞