蛋白质分离纯化

蛋白质的分离纯化①产物大多处于细胞内,提取前需将细胞破碎,增加了很多困难;②产物浓度较低、杂质多,而最后成品要求达到的纯度高,故提取较困难,且收率低,常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法;③产物都是大分子蛋白质,通常不稳定,遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引起失活。重组蛋白的分离纯化过程特点1蛋白质的分离方法（1）以大小或质量为依据：离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤（2）以电荷为依据：离子交换色谱（低离子强度、适当pH）DEAE-Sephadex、CM-Sephadex、DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）（3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数（4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提（5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩(1)以大小或质量为依据1.1离心1.2凝胶过滤1.1离心原理：以质量不同为分离依据离心力:5000-50000g处理量可达几升分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶

高速离心速度一般在20,000g以下。

超离心

相对离心力场速度在75,000g以上，在80,000~250,000g之间。利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。

1.主要分离小分子量酶。

2.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。

凝胶层析的基本原理：是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。1.2凝胶过滤A.原理：不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同，能进入微孔的小分子被阻滞，不能进入微孔的大分子未被阻滞(如图)。B.换句话说，分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的。C.其他名称：分子筛层析、凝胶渗透层析、排阻层析、Sephadex(交联葡聚糖）、Bio-Gel(交联聚丙烯酰胺）D.酶后期处理（小量试样）大分子小分子

凝胶颗粒凝胶排阻示意图解大分子小分子

凝胶颗粒凝胶排阻示意图解VoVt-Vo=Vi+VmVt凝胶柱床中Vt、Vo等关系示意图柱床体积空隙体积Vt:总体积Vo:外水体积Vi:内水体积Vm:凝胶基质体积葡聚糖凝胶操作流程：1）选择根据分子量大小范围选择凝胶。

凝胶如:G50排阻1,500-30,000（Sephadex）还有粗，中，细分，细的分辩率高,流速慢；粗的分辩率低,流速快。2）溶涨水浸或沸水煮，快而可以杀菌，防止微生物污染。3）装柱

不能有气泡，用缓冲液平衡4）上样按柱床体积计算约1/40左右。 然后用缓冲液洗脱。注意流速。5）再生稀盐和缓冲液洗涤，保存在液体中，为防止微 生物生长，加0.02%NaN3或20％乙醇。使用时要注意可能抑制你要分离的酶。(2)以电荷为依据2.1离子交换色谱2.2电泳2.3等电聚焦2.1离子交换色谱取决于带相反电荷基团的静电吸引。离子交换层析基本原理：是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。1.离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，琼脂糖等；2.离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用离子交换剂的基本性能3.如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数4.吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来5.不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐洗脱下来，达到分离纯化的目的

阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团 磺酸基（-SO3H）SP离子交换剂的分类

磷酸基（-PO3H2）

羧酸基（-COOH）CM

酚羟基（-OH）

阳离子交换剂：强酸型和弱酸型

可电离的基团 伯胺基（-NH2）

仲胺基（-NHCH3）

叔胺基（-N(CH3)2）DEAE

季胺基（-N+(CH3)3）Q离子交换介质的基本性质离子交换剂的分类强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱1）离子交换剂选择：考虑酶稳定性需要

酶蛋白在くpI的pH条件下稳定用阳离子交换剂。酶蛋白在〉pI的pH条件下稳定用阴离子交换剂在﹤pIpH,﹥pIpH条件下稳定二种交换剂都可用

2）如何选择强型和弱型交换剂

酶蛋白pI在<6或>9时考虑用强型离子交换剂

酶蛋白是强型或弱型离子考虑到酶的不稳定性，交换剂通用，选弱型。离子交换介质的选择原则12346789105等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂蛋白质净电荷pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内，应首选DEAE；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内，应首选CM.pH-+样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为小于介质交换容量的50%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数离子交换层析的基本操作样品洗脱102030405060708090离子交换层析的基本操作pH值分子浓度离子强度恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱解吸方法：改变pH（改变结合基团的电荷），提高溶液的离子强度（与酶竞争结合位置）使用规模可大可小纯化倍数为10左右，控制好条件可以更高

2.2电泳带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。原理：在外加电场的影响下，带电分子具有不同的运动速度。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。支持介质：纸、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺。2.3等电聚焦

依据：在pH梯度中的平衡位置。用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度，而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。分辩率高，pI相差0.01pH的酶与蛋白质可分离。注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和质量。（3）以溶解度变化为依据

3.1盐析--改变pH(等电点沉淀法)

3.2盐析--改变离子强度3.3PEG沉淀法

3.1改变pH(等电点沉淀法)

调整pH至酶的等电点。原理：溶解度随分子引力加大而减小，其他条件相同，当pH在等电点附近时,分子引力最大，蛋白质就沉淀。

一般不单独使用，配合其他方法使用。

3.2改变离子强度盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上所带的电荷而使溶解度提高。盐析：离子强度提高到超过某一数值，带电分子将会沉淀下来。1.在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。

2.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。

3.盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。

4.盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。

特点：1.最古老,但应用广

2.常用(NH4)2SO4，因为溶解度大

0℃时，(NH4)2SO4溶解706g/L;25℃时，(NH