第八章-生物材料检验课件

生物材料检验

Analysisofbiologicalmaterial主讲教师：蒋守芳副教授

院部：公共卫生学院生物材料检验

Analysisofbiological徽县铅中毒事件甘肃省徽县有色金属冶炼公司于1996年投产，是一家进行铅冶炼的企业，厂房建在村民密集区。该公司采用国家明文淘汰的落后生产工艺和设备，自1996年投产以来一直超标排污，是水阳乡部分群众铅中毒的重要污染源。10年来村民们多次向徽县有关部门反映过这家企业的污染问题，可经常是检查人员刚走，工厂就接着开工。徽县铅中毒事件甘肃省徽县有色金属冶炼公司于1996年徽县铅中毒事件甘肃省徽县有色金属冶炼公司造成严重的环境铅污染，引起周围居民的铅中毒，尤其是儿童。问题1：对周围居民进行健康检查，用什么指标反映居民铅中毒及其危害程度？徽县铅中毒事件甘肃省徽县有色金属冶炼公司造成严重的环陕西省西京医院对徽县水阳乡的儿童进行血铅检测，血铅含量大于350μg/L的11名孩子立即住院治疗。这些孩子最小的一岁零两个月，最大的15岁，血铅含量最高的619μg/L，最低的355μg/L。徽县铅中毒事件按照儿童高铅血症和铅中毒分级标准，血铅含量：100-200μg/L：高铅血症；200-250μg/L：轻度铅中毒；250-450μg/L：中度铅中毒；>450μg/L：重度铅中毒。陕西省西京医院对徽县水阳乡的儿童进行血铅检测铅的工业用途很广。制造合金、铅管、铅箔、铅板、蓄电池、印刷铸字、X射线和g射线的防护等；铅的氧化物多用于生产油漆、颜料、玻璃、陶釉、防锈剂、橡胶硫化促进剂等；四乙基铅用作汽油防爆剂。日常生活中接触铅及其化合物的机会亦多，如罐头食品、化妆品、某些药物、釉瓷容器等。铅的接触机会铅的接触机会铅的毒性、代谢和监测指标铅及其无机化合物主要以粉尘、烟、蒸气形式经呼吸道进入人体，亦可经消化道吸收；四乙基铅主要以蒸气形式经呼吸道进入人体，也可经皮肤、粘膜及消化道吸收。铅及其无机化合物的毒作用主要是造成神经、造血、消化等系统和肾脏的损害。吸收的铅进入血液后，95％与红细胞结合被输送到人体的各部位。一部分蓄积在肝、脑、肾、肌肉及血液中。体内的铅约有75%~80%随尿排出，约15％经粪便排出。铅的毒性、代谢和监测指标铅及其无机化合物主要以粉尘、烟、蒸气血铅能直接反映近期机体吸收铅的量，与空气铅浓度密切相关，被认为是目前最好的铅接触监测指标。尿铅可以反映铅从体内排出情况，能间接反映机体吸收铅的量。但由于尿铅排出受许多因素的影响，有时体内虽有大量铅蓄积，尿铅排出量并不高，因此尿铅是铅中毒的辅助诊断指标。铅对体内许多酶系统有干扰作用，造成体内物质代谢改变，如接触铅后，尿中δ-氨基-γ-酮戊酸、红细胞中游离原卟啉和血中锌原卟啉会增多，测定它们的含量，有助于铅吸收和铅中毒的诊断。血铅能直接反映近期机体吸收铅的量，与空气铅浓度密切相关，被认生物材料（biologicalmaterial）:指生物体的体液（血液）、排泄物（尿液、呼出气）、毛发和实验动物脏器组织的总称。生物材料检验（analysisofbiologicalmaterial）：研究生物材料中化学物质或其代谢产物或生物化学指标的分析测定方法的科学。生物监测（biologicalmonitoring）：指定期检测人体生物材料中化学物质或其代谢产物的含量或由它们所导致的生物效应水平，以评价人体接触化学物质的程度及对健康的影响。一、基本术语生物材料（biologicalmaterial）:指生物体正常值（normalreferencerange）：指正常人(无明显肝、肾及血液系统疾病，无职业有害因素接触史)的生物样品中某种成分的含量或生化指标值。常通过对某地区的正常人抽样调查所得结果进行统计分析。生物接触限值（biologicalexposure

limit，BEL）：指接触有害化学物的劳动者生物材料（尿、血、呼出气）中化学物或其代谢产物或其引起生物反应的限量值（最高容许浓度），用于保护绝大多数劳动者的健康。基本术语正常值（normalreferencerange）：指正二、生物材料检验的意义为职业中毒的诊断、治疗和预防提供客观依据；为评价环境污染对健康影响提供依据；为地方病和营养素缺乏病的诊断防治提供依据；为制订卫生标准、正常值或生物接触限值提供资料；检查青少年生长发育情况。二、生物材料检验的意义为职业中毒的诊断、治疗和预防提供客观依三、生物材料检验指标及选择

1、生物材料检验指标主要有三个方面：生物材料中化学物质的检验：如尿中Pb、Hg、Cd、Cr、Ni、V、Se、As等，血中Pb、Cr、Se、Zn、Cu、Fe、Ca、Mg的检验，呼出气中苯、甲苯、氯乙烯、三氯乙烯等。生物材料中化学物质代谢产物的检验：化学物质进入机体后，在体内被吸收、代谢产生代谢产物，需要对生物材料中某些代谢产物进行检验。如苯接触者尿中苯代谢产物70%-85%为苯酚，测定尿酚可作为苯的接触标志物。三、生物材料检验指标及选择1、生物材料检验指标主生物效应指标的检验：化学物质进入机体后，在体内引起某些生化、生理行为或其他方面的改变。可以选择适当的效应指标作为接触有毒物质的检测指标。如铅吸收或铅中毒时，尿中δ-氨基-γ-酮戊酸↑、红细胞中游离原卟啉↑、血中锌原卟啉↑；有机磷农药中毒时，全血胆碱酯酶活性降低。生物效应指标的检验：化学物质进入机体后，在体内引起某些生化、2、生物材料检验指标的选择原则以化学物质的代谢动力学和监测目的为基础，根据其在体内的吸收、分布、代谢和排泄情况选择指标，要求所选择的指标有一定的特异性和灵敏度，与接触剂量有较好的相关关系。2、生物材料检验指标的选择原则以化学物质的代谢四、生物材料检验结果的判定

目前多采用与正常值或生物接触限值相比较进行判定。由于受地理条件、环境污染情况及不同测定方法结果间差异等因素的影响，同一成分的正常值可因地区、方法的不同而不同。因此，在选用正常值时，应注意所采用的测定方法和地区差异。某些成分的含量除受职业接触的影响外，还与受检者的年龄、性别、生理状态、饮食和用药情况等因素有关，判定结果时应加以注意。四、生物材料检验结果的判定目前多采用与正常值或生第一节生物样品的收集保存与处理第一节

尿液血液唾液毛发指甲呼出气乳汁粪便骨骼动物的脏器组织生物材料检验的种类尿液呼出气生物材料检验的种类

选用的生物材料中被测物的浓度与环境接触水平、或与健康效应有剂量反应关系；

样品和待测成分(指标)足够稳定以便于运输和保存；

采集生物样品对人体无损害，能为受检者所接受。用得最多的是尿液，其次是血液和呼出气。头发生长非常缓慢，所采集的样品实际上是不同时期的混合样，其测定值与接触剂量的关系无法确定，主要用作代谢极慢金属的定性检验。选择生物材料的种类的两点要求选用的生物材料中被测物的浓度与环境接触水平、或与健一、尿样的收集与保存（一）尿样的收集时间（二）收集尿样的容器及保存条件（三）测定结果的校正一、尿样的收集与保存（一）尿样的收集时间(一)尿样的收集时间

晨尿：收集受检者早晨起床后的第一次尿样进行分析，收集较方便，对多数测定均能反映实际情况。24h尿：由于某些毒物从体内排出无规律，一昼夜间尿中含量波动较大，故常需收集24h尿混合后，取适量进行分析。所得结果不受饮水和排汗的影响，但收集24h尿样较麻烦，在夏天尿样易腐败；随机尿：收集方便，但由于尿中待测物的浓度波动较大，分析结果往往不能反映实际情况(一)尿样的收集时间晨尿：收集受检者早晨起床后的第一次

某些有毒有害物质的排泄速度快，当停止接触后，尿中被检物质的含量显著降低，欲了解机体接触该物质的情况，宜在工作班前、班中、班末或班后分别留取尿样进行分析。班前：进入工作岗位前1h班中：开始工作后2h至下班前1h班末：下班前1h之内班后：下班后1h之内某些有毒有害物质的排泄速度快，当停止接触后，尿中

(二)收集尿样的容器和保存条件24h尿样一般收集于清洁的2L硬质玻璃瓶中。由于收集时间较长，可加入少量防腐剂（如每升尿中加氯仿2～3ml），并注意贮于阴凉处。晨尿及随机尿通常收集于500ml清洁的硬质玻璃瓶或聚乙烯塑料瓶中。对测定尿铅、尿汞等样品，常在1L尿中加入硝酸5ml，以防腐、防盐类沉淀、防止汞挥发及容器壁吸附。盛放测定尿铅、尿汞的容器，需用稀硝酸浸泡，然后用水冲洗干净，晾干备用。(二)收集尿样的容器和保存条件24h尿样一般收集于清洁的（三）测定结果的校正尿中待测成分的测定结果一般以mg/L表示，但测定结果易受排尿量的影响，排尿量又与饮水量和排汗量有关，为减少饮水量和排汗量的影响，使一次尿样和24小时尿样的结果较接近，需对测定结果进行校正。校正方法有比重校正法和肌酐校正法两种。比重校正法：将尿中被测物浓度校正为标准比重(我国规定尿样的标准比重为1.020))下的浓度，校正公式为：（三）测定结果的校正尿中待测成分的式中C校--经校正后尿中待测成分的浓度(mg/L)；

C--测得的尿中待测成分的浓度(mg/L)；

1.020--为我国采用的尿的标准比重；’

d--实际测得的尿样比重；

K--校正尿比重到1.020的系数。比重校正法式中C校--经校正后尿中待测成分的浓度(mg/L)；比重校

一般情况下饮食、饮水量和利尿剂对肌酐的排出率影响不大，健康人一天排尿所排出的肌酐量变化很小，一般在1.8g左右。因此，可用经尿液排出1g肌酐所相应的待测成分的量来表示尿中待测物的浓度或经尿液排出1.8g肌酐所相应的待测成分的量来代表全天尿中待测成分的含量。校正公式为：肌酐校正法一般情况下饮食、饮水量和利尿剂对肌酐的排出率影响第八章-生物材料检验课件二、血样的收集与保存

血液中有毒物质的浓度，可反映机体近期接触该毒物的程度，常与体内吸收的毒物量呈正相关，由于血样具有含量较稳定、波动小、取样污染机会少以及不受肾功能的影响等优点，测定血中某成分的浓度意义更大。但取血手续较烦，受检者不易接受，在实际工作中，血样远不如尿样应用普遍。二、血样的收集与保存血液中有毒物质的浓度

血样的种类

血样可用全血、血浆或血清。全血：用注射器或取血管采集血液注入有抗凝剂的试管中，轻轻转动使血液与抗凝剂充分混匀。血浆和红细胞：将血液缓慢注入有抗凝剂的试管中，室温下放置或离心，分离后的上清液即为血浆，沉淀的红色部分为红细胞。血清：将血液缓慢注入干燥试管中，室温下放置15~30min，离心，分离后的上清液即为血清。血样的种类血样可用全血、血浆或血清。取血部位：

末梢血：自指头或耳垂采取收集微量血液。静脉血：自肘部抽取静脉血收集0.5ml以上的血液。取血时间：最好在早餐前。收集血液的容器：聚四氟乙烯或聚乙烯管；

抗凝剂：肝素0.1～0.2mg；1～2mg草酸钠或氟化钠。取血部位：挥发性毒物经呼吸道进人机体后，在肺泡气与肺部血液之间达到血气两相平衡，即挥发性物质在肺泡气相的分压和在肺末端毛细血管血液中的分压是相等的。因此，对呼出气或肺泡气中挥发性物质进行分析，可反映人体的摄入水平和环境空气中的水平。三、呼出气的收集与保存挥发性毒物经呼吸道进人机体后，在肺泡气与肺部血液之间达到血气呼出气作为评价接触挥发性化学物质的生物监测样品，其优点是样品收集方便，可以连续采样，样品中干扰物质少，易为受试者所接受。呼出气样品有混合呼出气和终末呼出气两种。尽力吸气后用最大力量呼气至不能再呼气为止所呼出的全部呼出气为混合呼出气；先尽力吸气，在平和呼气后，再尽力呼气至不能呼气为止的最后一段呼出气为终末呼出气。呼出气作为评价接触挥发性化学物质的生物监测样品，其优点是样品

呼出气的采集采样袋或注射器直接采样法，操作简便，适用于高含量样品，所采样品不便保存。活性炭吸附管在低温下吸附采样法，采样过程中待测物质被吸附而浓集在活性炭上，适用于较低含量样品，所采样品可以保存1周。呼出气的采集采样袋或注射器直接采样法，操作简便，适用于高含四、头发和指甲的收集与保存蓄积于头发和指甲中的毒物：如砷、镉、铬、汞、铅等。脱离接触后，毒物在尿液、血液中含量已明显降低，而在头发和指甲中含量仍然较高。通常采集枕部距头皮2cm(或5cm)以内的头发，经洗净、干燥、混匀后作为分析样品。四、头发和指甲的收集与保存蓄积于头发和指甲中的毒物：如砷、镉用途：毒物的毒性试验和毒理学研究，探讨毒物在机体内的分布和蓄积情况。法医学尸检。五、组织和脏器的收集与保存用途：五、组织和脏器的收集与保存要求：1.样品收集后应尽快进行检验；2.不能及时送检时，应将样品低温冷藏。

组织和脏器的收集与保存要求：组织和脏器的收集与保存生物样品的成分复杂，在分析前需对样品进行适当的预处理，以除去杂质，浓集待测成分，分离或消除干扰物质；在测定金属和非金属成分时，需将样品经过无机化处理，使其中的有机物完全破坏，待测成分转变成为某一价态；六、生物样品的预处理生物样品的成分复杂，在分析前需对样品进行适当的预处理，以除去当待测成分与干扰成分共存时，或待测成分的含量较低时，需通过溶剂萃取、挥发和蒸馏、共沉淀或采取固相萃取等方法将待测成分与干扰物质相分离，达到分离、净化和浓缩的目的。生物样品的预处理当待测成分与干扰成分共存时，或待测成分的含量较低时，需通过溶1.湿消化法2.干灰化法（一）消化方法主要用于测定无机样品时，破坏有机物，方法有湿消化法和干灰化法，可根据样品及待测元素的性质选用。1.湿消化法（一）消化方法主要用于测定无机样品用强氧化性酸，配合其它氧化剂，并结合加热，使所有有机物破坏，待测成分变成易溶的盐类。常用的氧化性酸类有硝酸、硫酸和高氯酸。常用的氧化剂有高锰酸钾和过氧化氢等。1、湿消化法用强氧化性酸，配合其它氧化剂，并结合加热，使所有取样品于凯氏瓶或锥形瓶中，加入不定量硝酸，缓缓加热直到剧烈反应停止冷却，慢慢加入一定量硫酸，加热直至溶液开始变黑时，从电炉或电热板上取下，慢慢加入硝酸再加热，如又变黑，再加硝酸，重复操作，直至冒白烟，在冷却时溶液应无色或淡黄色。硝酸和硫酸消化法

取样品于凯氏瓶或锥形瓶中，加入不定量硝酸，缓缓加

本法广泛用于破坏有机物质。优点：快速、易控制；缺点：不适宜破坏含较多碱土金属（铍、镁、钙、

锶、钡、镭六种金属元素）的有机物质。本法广泛用于破坏有机物质。是应用最广泛的一种有机物破坏方法，适用于含有机物较多的生物样品的消化。取样品于凯氏瓶或锥形瓶中，加硝酸若干毫升，摇匀，待反应平静时，加高氯酸和硫酸在电炉上加热，瓶内产生大量棕色气体。再加入数毫升硝酸，继续加热，直至冒白烟，冷却，加水5ml，再加热至冒白烟。

硝酸、高氯酸和硫酸消化法是应用最广泛的一种有机物破坏方法，适用于含有机物氧化能力强，反应速度快，消化温度低，挥发损失小。由于硝酸和高氯酸的沸点均较低，过量的酸液容易挥发除去。适用于含钙量高的样品和破坏蛋白质、碳水化合物之类的物质。

取样品于凯氏瓶或锥形瓶中，加一定量硝酸，缓缓煮沸30min，冷却，加高氯酸继续加热直至冒白烟、溶液无色或接近无色为止。硝酸和高氯酸消化法氧化能力强，反应速度快，消化温度低，挥发损失小。测定汞的特殊消化法回流消化法：称取粮食10克，置于消化装置锥形瓶中，加玻璃珠数粒，加45ml硝酸，l0ml硫酸，转动锥形瓶防止局部炭化，装上冷凝管后，小心火加热，待开始发泡即停止加热，发泡停止后，加热回流2小时。冷消化法：利用高锰酸钾-硫酸在低温下氧化尿中有机物，再用盐酸羟胺或过氧化氢将过量的高锰酸钾褪色，此法专用于分析尿汞时样品的消化。测定汞的特殊消化法回流消化法：称取粮食10克，置于消化装置锥加盖消化：加盖表面皿，节省消化试剂；成批消化：节省时间；预先浸泡：对毛发、指甲、脏器等较干燥的样品，加硝酸后浸泡过夜，样品容易消解，而且防止加热时产生气泡；加高氯酸消化：当样品难以分解时，可加高氯酸；加压消化：放在聚四氟乙烯消化罐内加压消化。湿式消化注意事项加盖消化：加盖表面皿，节省消化试剂；湿式消化注意事项将生物材料置于坩埚中，蒸发至干并炭化，然后在高温炉（马弗炉)中灼烧使灰化，直至样品中的有机物全部除去变成白色残渣为止。如经一次灼烧仍含黑色炭粒，应重复灼烧。残渣中加入适当试剂使之溶解，并用水稀释成样品溶液。2、干灰化法将生物材料置于坩埚中，蒸发至干并炭化，然后在高温优点：操作简便，加入试剂少、空白值低。缺点：费时较长。适用范围：处理大批样品。使用助灰化剂如硝酸、硫酸、硝酸镁和氧化镁、氢氧化钾等可以帮助灰化。优点：操作简便，加入试剂少、空白值低。方法：取适量样品于坩埚中，先用小火加热使其炭化，然后加入硝酸使残渣湿润，在小火上蒸干后，放入高温炉灰化4-6h，如不彻底，则再加硝酸直至样品灰化完全为止。

用硝酸作助灰化剂的灰化法优点：加硝酸灰化很少影响回收率，并有助于得到干净的灰分，灰分易溶于稀酸。方法：取适量样品于坩埚中，先用小火加热使其炭化，然后加入方法：取适量样品于坩埚中，先小火加热直到除去所有易挥发及易燃物质，冷却，沿器璧加入硫酸，湿润残渣，小心加热直至白色烟雾停止放出，再强热使得干净的灰分。最后加数滴硫酸湿润，缓缓加热直至冒白烟为止。用硫酸作助灰化剂的灰化法适用范围：含灰分较少的样品。缺点：氧化速度较慢。方法：取适量样品于坩埚中，先小火加热直到除去所有易挥发及易燃方法：取适量样品于坩埚中，加硝酸镁溶液浸泡，上面覆盖氧化镁粉末（氧化镁的作用是使残渣疏松，有利于灰化），先小火加热使样品蒸干并炭化，然后移置高温炉中灰化数小时，直至灰化完全为止。适用范围：砷测定时的灰化，使砷变为焦砷酸镁(Mg2As2O2)而避免挥发损失。

用硝酸镁和氧化镁作助灰化剂的灰化法方法：取适量样品于坩埚中，加硝酸镁溶液浸泡，上面覆盖氧化镁粉（二）分离方法分析有机物或其代谢产物，常用分离和净化的方法，以除去干扰成分，使被测成分适合分析的要求。（二）分离方法1．溶剂萃取法：利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度不同，通常使被测成分进入有机相，干扰成分留在水相，从而达到分离的目的。2.挥发法和蒸馏法:利用有机物质的挥发性来进行分离的方法。3.共沉淀法:当一种沉淀从溶液中析出时，溶液中某些组分随之被沉淀带下而混入沉淀中，这种现象称为共沉淀

常用的分离方法有以下几类：1．溶剂萃取法：利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度不同，通六、生物样品的测量方法可见光分光光度法紫外分光光度法荧光分光光度法原子吸收光谱法原子发射光谱法原子荧光光谱法1.光谱法

2.色谱法气相色谱法高压液相色谱法六、生物样品的测量方法可见光分光光度法1.光谱法3.其它方法极谱法溶出伏安法电感耦合等离子发射光谱法色-质联机气-质联机3.其它方法极谱法第二节生物材料检验方法研制和质量控制第二节

一、生物材料检验中建立测定方法的要求生物监测的应用越来越广泛：职业卫生与职业医学环境卫生学卫生毒理学危险度的评定临床医学一、生物材料检验中建立测定方法的要求生物监测的应用越来越广（一）基本原则1、方法的选择

根据生物样品的性质及测定毒物的种类，了解毒物的理化性质，查阅文献，结合实际情况，使建立的方法经济适用。金属毒物的测定：比色法、原子吸收法、电化学法；有机毒物的测定：气相色谱法、高压液相色谱法、荧光法等有关分析方法。（一）基本原则对选定分析方法的具体要求：（1）灵敏度高，一般要求达到ppb级甚至达到ppt级；（2）干扰少，避免繁琐的分离步骤；（3）操作简便，仪器设备易得，便于推广；（4）结果准确可靠。

注：ppm：partpermillion百万分之一ppb：partperbillion十亿分之一ppt：partpertrillion万亿分之一对选定分析方法的具体要求：2、样品的收集与前处理

采集生物样品时，应注意避免污染，采样器(如针头)及贮存器都要严格清洗干净，目前盛尿的容器大多采用聚乙烯瓶。

根据测定方法的要求对生物样品进行必要的前处理。2、样品的收集与前处理用电化学法测定生物样品中的金属毒物时，必须用氧化性的酸和强氧化剂结合加热将生物样品中的有机物质破坏完全，而剩下比较单纯的被测无机离子。例1用电化学法测定生物样品中的金属毒物时，必须用氧用色谱法测定生物样品中的某一有机化合物（或代谢产物）的总量时，绝不能用强氧化性的酸和加热的方法，而是须将生物样品(如尿、血)中的被测物(或代谢物)的结合物(常与葡萄糖醛酸或其他物质结合者)，经酸水解后，再用适当的有机溶剂进行萃取分离。例2用色谱法测定生物样品中的某一有机化合物（或代谢3、试剂的要求及配制（1）试剂的要求：一级：优级纯二级：分析纯三级：化学纯四级：实验纯专用试剂纯度：色谱纯光谱纯3、试剂的要求及配制专用试剂纯度：（2）试剂的配制试剂配制正确与否，直接关系到分析结果的好坏。在配制时，要用纯水，称量一定要正确，配好后，应标明配制物的名称、浓度、日期、存放要求和配制人员姓名。（2）试剂的配制（二）试验阶段1、预试验分析方法的初步建立：根据选定的分析方法的要求，结合实验室条件，初步拟定一个实验方法，按拟定的操作步骤进行实验，如此重复4～5次实验，将各次实验结果经数据处理后，一般可看出方法的可行性及其测量范围。（二）试验阶段消化条件(消化温度、消化酸的种类及比例)试剂用量反应温度pH值稳定性条件选择实验条件筛选：单因素改变法和正交试验法。消化条件(消化温度、消化酸的种类及比例)条件选择实验条件掩蔽剂：光度分析和电化学分析配位剂：原子吸收分析色谱柱的结合与解离效果（3）排除干扰掩蔽剂：光度分析和电化学分析（3）排除干扰样品成分复杂，上面选择的条件不一定就适用，因此，要进行模拟实验，其作法是在同一样品中分别加入0-nμg的3-5个不同量标准，经过已确定的预处理后，按规定的操作要求进行测定，观察它的结果是否满足实际需要，否则作适当改进。（4）模拟实验样品成分复杂，上面选择的条件不一定就适用，因此2、正式实验

在预试验最后确定的条件下，对有关的反应条件，如溶液的酸度、试剂用量、反应温度、反应完全的时间、生成物的稳定性以及共存物的影响等，都要一一再进行验证，保证整个分析条件达到最满意的结果。2、正式实验（三）可靠性试验

1、标准曲线

2、准确度实验：加标回收法、标准比较法、方法对比法。

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