肺热清解口服液与处方中总黄酮的抗菌效果比较

肺热清解口服液与处方中总黄酮的抗菌效果比较

肺热清解口服液是黄浦医院根据医院的处方和临床医疗需要自行制备的复方中药制剂。它由10种中药组成：黑莓皮、芦苇皮和弗洛伊木林皮。具有清热、宣传肺、止咳、哮喘的功效，主要用于肺热咳嗽，主要用于急性支气管炎和肺部感染的治疗。桑白皮为该复方制剂中的君药之一,主要化学成分有总黄酮类化合物、香豆素类化合物、多糖类化合物等,研究表明桑白皮的黄酮具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抑制蛋白糖基化等作用。除了桑白皮中含有总黄酮之外,该复方中君药之一的芦根也含有总黄酮类化合物。肺热清解口服液用于治疗肺热咳嗽已经获得显著的疗效,为了将肺热清解口服液更好地应用于临床,根据桑白皮、芦根在处方中的地位及其总总黄酮作用的研究概况,对肺热清解口服液和处方中的总黄酮抗菌、解热实验进行研究,这不仅可以为肺热清解口服液的清热宣肺、止咳平喘的功效提供科学依据,还为肺热清解口服液开发成新药奠定基础。1设备和材料1.1实验仪器和设备ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂),400克摇摆式高速中药粉碎机(郑州长城科工贸有限公司),4号(65目)药筛(郑州长城科工贸有限公司),YP3001N型电子天平(广州仪通兴仪器仪表有限公司),B-200型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂),SHB-ш循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),LDZX-50FAS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),SN-CT-1FD洁净工作台(上海博讯实业有限公司),数码显示电热培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),红外电热鼓风干燥箱(重庆永生实验仪器厂)。1.2实验药材鉴定芦根、瓜蒌皮、甘草、桑白皮、川贝、地龙干、野菊花、冬瓜仁、车前子、天竺黄(均购于广州致信药材有限公司),以上实验药材经田素英副教授鉴定均为正品。肺热清解口服液(中山市黄圃人民医院,批号20100825),双黄连口服液(东莞市亚洲制药有限公司,批号20112023),高活性酵母(安琪酵母股份有限公司,批号20110203),营养肉汤琼脂(天津德晟生物技术有限公司,BG,20070621),水为无菌水,其它所用试剂均为分析纯。1.3广东东南角的清洁动物房SPF级别,SD大鼠,购于广东省实验动物中心;饲养于广东药学院中山校区的清洁动物房内,室内湿度为70%±10%,温度为(20±2)℃。动物实验许可证号:SCXK(粤)2008-0002。1.4病毒肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌(广东药学院基础学院微生物教研室提供)。2方法和结果2.1单因素方差分析使用SPSSV17.0对不同组别进行单因素方差分析(F检验),检测各组间是否有显著性差异,结果以(ˉx±s)表示;P<0.05说明具有统计学意义。2.2乙醇回收及乙醇萃取工艺按处方中(每种药的1/50的重量)的中药材粉碎后过4号(65目)筛,加10倍水,置烧杯中浸泡30min,水浴80℃加热,提取2次,每次60min,过滤,合并滤液,低温浓缩至约80ml。调节含醇量至70%,静沉44h,取上清液回收乙醇,浓缩至30ml;先用乙醚萃取3次(每次30ml),收集上层(乙醚层);然后取下层用乙酸乙酯萃取3次(每次30ml),收集上层(乙酸乙酯层);合并乙醚、乙酸乙酯萃取液,再进行浓缩;用无菌水将总黄酮提取物的浓度分别调整为每毫升含4g原药材和每毫升含1g原药材。2.3抗菌试验2.3.1菌种的培养取4支种管(4种菌种:肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌)和4支肉汤培养基管,在无菌情况下,挑取斜面上的菌苔少许,迅速将菌种移种到肉汤培养基管,将培养基置于37℃恒温箱培养18h。2.3.2溶解营养猪肉粉液体培养基的制备:按质量体积比2∶100的比例取营养肉汤粉、蒸馏水置于三角烧瓶中,搅拌使营养肉汤粉完全溶解,备用。制备固体培养基:按质量体积比33∶1000的比例取营养肉汤琼脂粉、蒸馏水置于三角烧瓶中,灭菌,冷至50～60℃时,在无菌情况下将培养基倾注到无菌空平皿内(直径90mm平皿倾注大约20ml灭菌的培养基),凝固后即成平板培养基。2.3.3最小抑菌浓度测定结果采用连续(试管)稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。取无菌试管10支进行1～10编号,分别向各试管加入2.0ml普通肉汤培养液;吸取药物(肺热清解口服液、4g/ml的总黄酮提取液)2.0ml加入到1号试管中,混匀后取2.0ml加入2号试管,依次稀释到8号试管,吸出2.0ml弃去,分别标出1～8号试管的浓度(肺热清解口服液1～8号试管浓度:499.00,249.50,124.75,62.38,31.19,15.59,7.80,3.80;总黄酮1～8号试管浓度:2000.00,1000.00,500.00,250.00,125.00,62.50,31.25,15.63;原药材mg/ml);其中9号试管为肉汤无菌生长对照管,10号试管为细菌生长对照管;除9号试管外,用无菌移液管在其余的试管中加入上述菌种菌液0.1ml,混匀后置于37.0℃培养箱,孵育18h;观察并记录结果,未见细菌生长的最低药物浓度管即为药物的最低抑菌浓度(MIC)。从上述无菌生长的试管中(从MIC浓度低一级稀释度开始)中挑取培养液,划线接种普通肉汤琼脂平板,然后送37.0℃培养箱再培养24h,把平皿上菌落数<5个的最小药物浓度作为最小杀菌浓度(MBC)(结果见表1)。从表1中可以看出,肺热清解口服液对肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度、最小杀菌浓度均小于总黄酮的抑菌浓度,说明肺热清解口服液对上述的4种菌种的抑制强于总黄酮。2.3.4总黄酮的抑菌效果用无菌小刀在普通肉汤琼脂平板上挖一条沟槽(大小根据琼脂平板做决定,槽内培养基弃去);在沟槽侧边紧挨沟槽垂直划线接种上面4种菌种;用吸管将肺热清解口服液、总黄酮提取液(原药材4g/ml)、(原药材1g/ml)、无菌水(阴性对照)、双黄连口服液(阳性对照药物)分别加入普通肉汤琼脂平板的沟槽内,以装满沟槽内但不溢出为度。将平板平置于37.0℃恒温箱培养24h;观察各细菌的生长情况,测量沟槽与试验菌间的抑菌距离(结果见表2)。从表2中可以看出,挖沟法实验中,总黄酮在高浓度(原药材4g/ml)时,对肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌的抑菌效果均优于肺热清解口服液(原药材0.498g/ml)的抑菌效果;但是,总黄酮在低浓度(原药材1g/ml)时,对肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌的抑菌效果均弱于肺热清解口服液(原药材0.498g/ml)的抑菌效果。2.4各组大鼠前近代前前感染情况的比较连续3d测量大鼠的肛温,选肛温差(△t)在3℃左右的大鼠均匀地分为4组,每组8只,分别为肺热清解口服液组(口服液组)、总黄酮提取物组(原药材1g/ml)(总黄酮组)、双黄连口服液(阳性组)、生理盐水(空白组)。按组别分别给大鼠灌胃给药(剂量:1ml/100g),连续4d早上给药,第5天早上按1ml/100g的剂量给大鼠皮下注射10%酵母粉混悬液,其中空白组大鼠的肛温升高>0.8℃时才计造模成功;在注射酵母的第3h,按分组给大鼠灌胃给药(剂量:1ml/100g),并开始测量大鼠的肛温,以后每隔1h测量1次,测到第9h(共测量7次)即可(结果见图1和表3)。从表3中可以判断:肺热清解口服液组与总黄酮组比较,具有显著性差异的时间为第6h;肺热清解口服液组与空白组比较,具有显著性差异的时间为第3、4、5、9h。总黄酮组与阳性组比较,具有显著性差异的时间为第5、6、7h;总黄酮组与空白组比较,具有显著性差异的时间为第3、4、5、6、7、8、9h。阳性组与空白组比较,具有显著性差异的时间为第3、4、6、8h。从上述的结果可以判断,肺热清解口服液、总黄酮均有解热的作用;而且,总黄酮在第3～8h的解热效果略胜于肺热清解口服液,特别是在第6h,两者存在显著性差异,说明此时总黄酮的解热效果强于肺热清解口服液。3菌种的选择及对10%酵母粉混悬液的抑菌效果抗菌实验结果表明,肺热清解口服液与处方中的总黄酮对肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌均有抑制作用;且肺热清解口服液(原药材0.498g/ml)抑菌效果比总黄酮(原药材1g/ml)抑菌效果更显著。从挖沟法抗菌实验结果可以看出:当处方中的总黄酮的浓度很高(原药材4g/ml)时,抑菌效果很显著;但是低浓度(原药材1g/ml)时,抑菌效果比肺热清解口服液(原药材0.498g/ml)抑菌效果还差。肺热清解口服液比双黄连口服液的抑菌效果略差,这可能与两者的处方组成不同有关。本实验所选取的肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌都是肺部感染常见的菌种;本研究关于菌种的选择是为了体现出肺热清解口服液的功效和临床应用的特点,符合中药药理研究思路的基本要求。解热实验结果表明,肺热清解口服液和处方中的总黄酮均能够对10%酵母粉混悬液引起大鼠发热而解热作用;除了第6h总黄酮的解热效果明显优于肺热清解口服液外,其他时间段中两者不存在显著性差异。总黄酮在第3、4、5、6、7、8、9h均有明显的解热作用