二喹啉甲酸法测定食品中蛋白多肽的研究

二喹啉甲酸法测定食品中蛋白多肽的研究

蛋白质和养分分析在蛋白质组、营养功能、生理代谢等研究领域发挥着重要作用。用于蛋白多肽定量的方法有很多,常用的方法包括双缩尿法、福林-酚法(Lowry)、考马斯亮蓝法(Bradford)、二喹啉甲酸(BCA)法、凯氏定氮法等。这些方法的原理不同,所受的影响因素也各不相同。因此,不同的方法其优点和局限性不同,在定量分析蛋白多肽时要选择适宜的方法。BCA法是美国的Smiths等在1985年对Lowry法的一种改良方法。BCA法具有结果准确、灵敏快速、经济适用等优点,已广泛应用于医学、生物学、分析化学和食品等领域[1,4,5,6,7,8,9,10,11]。例如,BCA法受表面活性剂和有机溶剂的影响较小,可用于反胶束萃取法萃取的蛋白分析。受尿素的影响较小,可用于牛乳蛋白质的定量分析。文中对BCA法的原理、测定方法、影响因素和消除方法,以及BCA法的优点进行了系统的论述。1化合物bca法BCA法反应原理为蛋白质将二价铜离子还原成亚铜离子,后者在碱性条件下与BCA络合生成紫红色络合物(图1)。此化合物在540~590nm内有最大吸收波长,反应物的颜色和蛋白浓度在一定范围内具有线性关系。BCA法反应原理包括2个方面:一是蛋白中的肽键将Cu2+还原为Cu+,并且在60℃,肽键将Cu2+还原为Cu+的作用比在室温更大;二是蛋白中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等还原性氨基酸将Cu2+还原为Cu+,这一反应与温度关系不大。2标准曲线及配合物检测BCA的测定方法如下:A液:BCA-Na21g、Na2CO3·H2O2g、酒石酸钠0.16g、NaOH0.4g、NaHCO30.95g溶于80mL水中,用1mol/LNaOH调pH值至11.25,定容至100mL。B液:CuSO4·5H2O4g,加水定容至100mL。测定时取A液100体积与B液2倍体积混合,配制成工作液。取BSA标准品适量配制成1mg/mL的标准蛋白溶液,配制一系列蛋白浓度梯度绘制标准曲线。取样品溶液0.1mL与工作液2.0mL混合,37℃保温30min,于562nm处测定吸光度A,根据标准曲线计算样品中蛋白的浓度。BCA钠盐是稳定的水溶性化合物。正常的工作液应当是果绿色。工作液在室温保存1周,BCA结果无显著差异。3影响因素3.1反应温度的影响在室温和37℃,随着反应温度的上升,吸光值升高。但在不同温度下,BCA的标准曲线相似。因此,研究者可根据需要自由选择反应温度。在0~60min的反应时间内,随着反应时间的增加,吸光值上升。在室温和37℃,颜色吸光值随着反应时间的延长而增加,以每分钟0.25%的速度增加。在60℃反应30min,显色反应的A值在60min内无显著变化。BCA法的最低测定值与反应温度有关。在37℃时,一般适用于浓度较高的样品(>50μg/mL),但是色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化(37℃检测的蛋白浓度范围为20~2000μg/mL);在60℃(增强法),一般适用于浓度较低的样品(<50μg/mL),色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化。因此,能大大提高检测灵敏度(60℃检测的最低蛋白质浓度可达5μg/mL)。3.2不同ph值对bca测定的影响当样品和工作液以1∶20混合时,样品中含有0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH不影响BCA法测定蛋白。蛋白溶液样品的pH值为4.0、6.7、8.0时对BCA测定无显著影响。随着pH值从12降低到11,反应的颜色下降。但是,在pH11.25,反应颜色产生的速率最快。BCA测定A液由Na2CO3和NaHCO3组成缓冲溶液,将缓冲溶液的pH从11.25降低到10.7,可以增强缓冲溶液的缓冲能力,从而增强对样品pH值的耐受范围。但是,反应的颜色会有一定的下降。将反应体系的pH值从11.25降低到9.4,可以将反应体系中的酒石酸钠试剂去除,从而可以简化反应液的配制。3.3乳化糖对bca和铜离子的影响麦芽糖、葡萄糖、a-乳糖、VC、VB1影响BCA的测定。果糖、乳糖、葡萄糖、N-乙酰基葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖对BCA的影响顺序减弱。非还原性糖,蔗糖和a-甲基葡萄糖对BCA的影响较小。在750μg/mL蛋白的浓度下,添加0.0125~0.125mol/L非还原糖,蛋白量增加6%~15%。多酚化合物可以将二价铜离子还原为一价铜离子,从而影响BCA和铜离子的反应。因此,BCA法不能直接用于含有多酚化合物的蛋白样品分析,例如葡萄酒。此外,与蛋白结合的糖和多酚也会影响蛋白的测定。3.4不同凝胶电泳成分对bca法定量蛋白的影响尿素影响Lowry法、BCA法和考马斯亮蓝法定量分析蛋白,并且具有浓度效应。在空白对照中,尿素并没有背景读数。因此,尿素对蛋白测定的影响是造成蛋白的伸展,肽键或者氨基酸残基暴露,从而使背景读数增加,影响蛋白定量。但是尿素在0.5~6mol/L内,对BCA测定蛋白量的影响在±5%以内。蛋白浓度在0~2000μg/mL内,具有良好的线性关系;分别加入100μg/mL和1000μg/mL蛋白,其加标回收率在98%~103%和99.9%~100.2%。细胞裂解液(尿素、硫脲、Chaps、DTT、EDTA、pH)影响BCA法定量蛋白。BCA法测定允许的最高浓度是:尿素3mol/L,Tris250mmol/L,Chaps5%,吐温205%,TritonX100和DTT1mmol/L。1%Chaps影响Lowry法,但是2%的Chaps几乎不影响BCA和考马斯亮蓝法。0.125%~0.5%的DTT影响Lowry法和BCA法,而在此范围内,不影响考马斯亮蓝法。2种或3种凝胶电泳成分组合后,对BCA法蛋白测定具有协同或拮抗效应,而不是单纯的增加效应。尿素和Tris对BCA法的影响具有协同效应。因此,BCA法能够耐受的组合浓度需要实验后确定。两性电解质(ampholytes,IPG)影响Lowry法、BCA法和考马斯亮蓝法的测定。IPG严重影响Lowry法测定,并具有剂量效应。在两性电解质中,三肽结构或三肽类似结构催化双缩脲反应中的铜离子还原。BCA法对增溶蛋白的去污剂耐受力强,4mol/L的盐酸胍和3mol/L的脲对其无影响。SDS显著影响考马斯亮蓝法的测定,而BCA法对SDS具有一定的耐受性。此外,铜离子螯合剂-EDTA显著影响BCA法测定。因为EDTA螯合铜离子,阻止了蛋白和铜离子的反应。3.5ca反应中bca法定量蛋白的测定除了还原性氨基酸影响BCA法以外,其他一些氨基酸也影响BCA反应。甘氨酸和赖氨酸的浓度低于125mmol/L时,对BCA法定量蛋白无显著影响,测定回收率在91%~106%。当高于125mmol/L后,则影响BCA法定量蛋白。3.6蛋白质的提取脂类物质影响BCA法的测定,造成结果偏高。测定含有脂类的蛋白样品时,需要用溶解脂类的有机溶剂(例如,乙醇)沉淀蛋白,用蒸馏水或去离子水重新溶解蛋白进行测定,可避免脂类物质的影响。磷脂浓度在12mg/mL的条件下,对BCA法的测定没有影响。3.7添加钙离子对蛋白含量的影响钙离子影响BCA法测定蛋白。蛋白在750μg/mL的浓度下,添加钙离子0.5%~10%,蛋白含量增加8%~13%。生物胺也可以把二价铜离子还原为一价铜离子,从而影响BCA法定量分析蛋白。4sds-tca法食品基质成分复杂,直接用BCA法定量分析蛋白容易受到很多干扰物质的影响。例如,BCA法直接测定葡萄酒和啤酒中的蛋白含量,就容易受到其中很多还原糖和酚类等还原性物质的干扰。因此,采用BCA法定量分析这样的样品,需要去除干扰物质后测定。对于含有干扰BCA分析的样品,可沉淀蛋白后测定,以消除干扰物的影响。采用乙醇、脱氧胆酸盐或三氯乙酸(TCA)可有效去除干扰物质对BCA测定的影响。调整样品的pH为BCA工作液的pH可以有效消除干扰物质的影响。加入一定量的SDS,可以消除脂质对BCA法测定的影响。碘乙酰胺(IAA)可以消除还原剂(例如DTT)的影响,但是当DTT/IAA的体积比在1∶10~1∶100内,IAA只能消除还原剂80%的影响,而20%的还原剂仍然会造成BCA显著的背景读数。用于蛋白沉淀的(NH4)2SO4、TCA、丙酮等试剂影响BCA法的测定,而1mol/LHCl可消除这些试剂的影响。因为蛋白沉淀聚集物中仍然含有沉淀试剂成分影响BCA的测定,特别是采用微量法测定蛋白。丙酮处理可以消除半胱氨酸对BCA法测定的影响。蛋白沉淀中含有的TCA可能在BCA反应中改变了反应的pH,因此对BCA反应有淬灭作用。1mol/LHCl体积分数从1%~4%,不影响BCA的测定。3mol/LTCA的体积分数从1%~4%可导致蛋白含量下降10%~50%。HCl在沉淀蛋白过程中可以挥发,而TCA不挥发。溶液中高于5%的(NH4)2SO4影响BCA法的测定。因此,蛋白沉淀中低于5%的(NH4)2SO4可被简单的蛋白沉淀方法所消除。5干扰物的选择BCA法可分为常量法和微量法2种。常量法的反应液和样品的总体积在1~4mL,微量法在20~200μL。其中微量法快迅、节省试剂和药品,特别适合于测定大量样品。采用微量法时,对0.5~10μg/mL的蛋白质样品可准确测定。以不同蛋白作为标准品进行定量分析,BCA法测定值变化较小(肽键反应)。Lowry法将双缩脲反应和福林-酚反应结合,使测定蛋白的灵敏度大大提高。但是,很多能和福林-酚试剂反应的化合物都会影响蛋白的测定。例如,多酚类化合物。与Lowry法相比,BCA法所用试剂及生成的呈色物质更加稳定。与Lowry法和Bradford法相比,BCA法的显著优点是受杂质影响较小。影响BCA法、Lowry法和考马斯亮蓝法的干扰物见表1和表2。含有还原剂或铜离子螯合剂的样品适合采用考马斯亮蓝法,而含有表面活性剂的样品适合采用BCA法。BCA法的反应原理是蛋白分子中的肽键在碱性条件下将二价铜离子还原为一价铜离子,后者与BCA结合形成紫色络合物。因此,BCA法可用于小分子多肽的测定。含0.1g/mLSDS的0.1mol/LNaOH多肽溶液在95℃热变性5min,采用BCA法在37℃加热30min可快速、准确经济地测定未知样品的多肽含量。BCA法测定多肽的加标回收率在96%~107%。Bradford法的反应原理是蛋白质分子内带正电荷的赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基与考马斯亮蓝染料分子内带负电荷的基团结合,从而可以测定蛋白含量。考马斯亮蓝法是通用的、灵敏的、半定量的方法。蛋白标准品不同,含有的赖氨酸、精氨酸和组氨酸的比例不同,采用考马斯亮蓝法测定的蛋白含量就不相同。因此,采用考马斯法定量蛋白需要选用适宜的蛋白标准品。考马斯亮蓝染料分子不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合。所以考马斯亮蓝法不适用于对多肽化合物的定量测定,特别是小分子的多肽化合物。此外,黄酮类化合物和碱性缓冲液影响考马斯亮蓝法的测定。双缩脲法的反应原理是蛋白分子中的肽键在碱性条件下与铜离子反应形成紫色络合物,反应形成的颜色与蛋白的分子质量和氨基酸残基无关。因此,双缩脲法可用于测定蛋白和多肽,但是灵敏度低,适合测定含量较高的样品。BCA、考马斯亮蓝法和Lowry法