一株肠-水两相流降解垃圾中微生物的细菌一株丝状真菌的鉴定及其对四类有机物降解能力的研究

一株肠-水两相流降解垃圾中微生物的细菌一株丝状真菌的鉴定及其对四类有机物降解能力的研究

随着我国城市化进程的加快，人口的持续增长和高密度腐败的集中，剩余垃圾的数量每天都在增加。虽然一家一户的厨余垃圾数量并不多,但千家万户汇集的总量却相当庞大,其来源分散不易收集,难以进行堆肥或饲料加工等资源化利用,同时其有机质含量高,水分大极易腐烂发臭,对垃圾填埋或焚烧处置带来诸多难题。因此研发家庭厨余垃圾的微生物降解原位消除技术,实现就地产生就地消纳,是解决城镇居民生活有机垃圾造成严重环境污染问题的良好途径。厨余垃圾是居民在生活消费过程中形成的一种生活废物,其化学组成上,主要包括淀粉、纤维素、蛋白质、脂类。筛选获得对这四类大分子有机物具有高效降解能力的微生物菌株对厨余垃圾的微生物降解原位消除技术至关重要。为此,本研究对先期工作中分离获得的一株丝状真菌进行了分类学鉴定并对其淀粉、纤维素、蛋白质、脂类降解能力进行了检测。1材料和方法1.1试验中的蘑菇采用真菌选择性培养基从有机肥中分离、纯化获得一株丝状真菌,并保藏于本实验室,代号为No.1。1.2四种类型的有机物质的分解能力1.2.1培养基的制备取对数生长期No.1菌液点接于蛋白质、淀粉、脂肪、纤维素培养基平板,观察蛋白质降解圈或菌落直径随时间的变化。四类大分子有机物培养基配方如下:蛋白质培养基:脱脂奶粉50g/L,可溶性淀粉10g/L,酵母膏5g/L,KH2PO41g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,琼脂20g/L,pH7.0~7.2。脂肪培养基:(NH4)2SO42g/L,K2HPO41g/L,KCl0.5g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,FeSO40.01g/L,琼脂20g/L,pH自然,橄榄油乳化液12mL(橄榄油:20g/L聚乙烯醇(PVA)为1∶3,转速1000r/min,5min),加溴甲酚紫。纤维素培养基:K2HPO40.50g/L,MgSO40.25g/L,CMC-Na1.88g/L,刚果红0.20g/L,琼脂16.00g/L,明胶2.00g/L,pH7.0。淀粉培养基:蛋白胨10g/L,可溶性淀粉2g/L,牛肉膏5g/L,NaCl5g/L,琼脂20g/L,pH7.0~7.2。上述培养基均在121℃下灭菌20min,倒平板,备用。1.2.2膜蛋白的酶催化作用(1)蛋白酶活性测定种子培养液:K2HPO47.0g/L,KH2PO42.0g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,干酪素4.0g/L,酵母膏6.0g/L,NaCl0.5g/L,甘油7.0g/L,CaCl20.067g/L,pH7.0,121℃灭菌20min。蛋白酶活力单位定义为:酪蛋白在酶催化下每min水解得到1μg酪氨酸时所需酶量。(2)淀粉酶活性测定种子培养液:淀粉10g/L,蛋白胨5g/L,K2HPO42g/L,NaCl1g/L,CaCl20.1g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,121℃灭菌20min。淀粉酶活力单位定义为:淀粉在酶催化下每min水解形成1μg还原糖时所需酶量。(3)脂肪酶活性测定种子培养液:NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L,NaCl10g/L,橄榄油20g/L,CaCl20.3g/L,NH4Cl0.3g/L,121℃灭菌20min。脂肪酶活力单位定义为:脂肪在酶催化下每min水解形成1μmol脂肪酸时所需酶量。(4)纤维素酶活性(CMCase)测定种子培养液:牛肉膏1.5g/L,蛋白胨1.0g/L,CaCO32.0g/L。分装于试管至7cm深层,并放入1cm×6cm滤纸条1条,121℃灭菌20min。纤维素酶活力单位定义为:纤维素在酶催化下每min水解形成1μg葡萄糖时所需酶量。1.3分类评价1.3.1社会学观察采用显微镜(Nikon,EclipseE600)对菌株No.1进行形态观察。1.3.2血液检测将菌液滴于血平板上,在30℃生化培养箱中培养24h.1.3.3pcr扩增引物DNA提取方法刮取少量真菌菌丝,加10mMTris-HCl缓冲液20μL,80℃水浴30min,然后冰浴5min,4℃12000r/min离心5min。取上清液作为模板DNA直接用于PCR扩增。18SrDNA的PCR扩增用于18SrDNA的PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′,反向引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系(20μL)为:10×PCRbuffer2μL、dNTP(2mmol/L)2μL、MgCl2(25mmol/L)1.6μL、正、反向引物(5mmol/L)各2μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL、模版DNA1μL、双蒸水补足至20μL。PCR程序如下:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,进行35个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物的纯化和测序由上海英骏生物技术有限责任公司完成。1.3.4系统繁殖的分析2结果与分析2.1菌落直径的测定菌株No.1在蛋白质,脂肪、纤维素和淀粉培养基平板上的菌落的直径变化如图1所示。接种1d后,No.1在蛋白质和淀粉平板上的菌落直径都超过2cm;3d后在蛋白质、淀粉、脂肪和纤维素平板上的菌落直径分别达8.7、4.5、3.1和4.2cm。说明该菌株对蛋白质具有很强的降解能力,对淀粉、脂肪和纤维素也有较强的降解能力。2.2胞外酶活性测定蛋白质、纤维素、淀粉、脂肪等有机大分子物质微生物不能直接吸收利用,而是通过分泌到体外的胞外酶的作用将大分子有机物水解转化为简单的低分子有机物质,如单糖或氨基酸、有机酸后才能通过微生物细胞膜,供生长代谢或自身物质转化之用。因此本研究所测定的酶活都是胞外酶。由表1可见,培养1d后,分别在菌液中检出了较高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性,第6天才检出纤维素酶的活性。上述结果进一步表明,该菌株对蛋白质、淀粉和脂肪有较强的降解能力,对纤维素也有一定的降解能力,可作为食物垃圾原位降解的候选功能菌株。2.4no.1重组菌株的鉴定如图2所示,No.1的菌丝无隔膜,气生菌丝如白色棉絮,无匍匐菌丝及假根。孢囊梗不成束,单生。孢囊梗直接由菌丝伸出,呈分支状,孢子囊球形。孢子囊破裂后释出孢子。初步鉴定为毛霉属(Mucorsp.)的一个种。同时,在血平板上无溶血反应。提取No.1菌株的18SrDNA经PCR扩增获得683bp序列,与GenBank中核酸数据进行比对分析,并利用数据库重相似的18SrDNA序列构建系统发育树,如图3所示,No.1同雅致放射毛霉(ActinomucorelegansAY243955)的相似性高达99%。因此,命名菌株No.1为A.elegansNo.1。3观点4:两种功能菌的筛选结果对本实验室分离、筛选、保藏的一株丝状真菌No.1,通过形态观察和18SrDNA的PCR扩增获得的683bp序列与GenBank比对和系统发育树分析,将其鉴定为雅致放射毛霉(A.elegansNo.1)。同时,根据对No.1该菌株进行在蛋白质、淀粉、脂肪和纤维素培养基