放射毛霉胞外和胞内蛋白酶的研究

放射毛霉胞外和胞内蛋白酶的研究

结果表明，在早期阶段，由酪氨酸酶（主要是内醇酶）产生的细胞外部酶（主要是内醇酶）的水解作用。随着发酵，细菌体溶解并释放细胞内酶。由于细胞内酶主要是氨基酸和氨基酸酶，因此喂食的发展主要是在发酵的后期，即细菌体溶解后，即含有不同细胞表面的细菌——细胞内外和内酶在酪氨酸酶中的作用。hwalwalwalwalwalwalwalwal组、布雷西泮（m.praini）和梨毛菌（m263-3）的脱丝酶（m）。结果表明，这些细胞酶主要结合在丝表面的细胞表面的异质醇酶，而对细胞醇是否存在于异质醇是否存在的研究还不够。《退耕地生物化学》是中国传统腐殖剂中常见的优良菌株之一。关于酶的科学研究主要集中在细胞表面的生产条件和特性上。为了更好地开发一种优雅的辐射促生素酶，作者利用超声粉碎、蛋白质电泳和高压液相层析成像（hplc）等技术对优雅的市场经济中的同胞和内源性丙烯酸进行了比较。1材料和方法1.1豆腐坯、试剂和仪器菌种:雅致放射毛霉(ActinomucorelegansAS3.227),由北京王致和腐乳厂提供;豆腐坯:由北京王致和腐乳厂提供,切成2.5cm×2.5cm×2.4cm的方块;试剂:所用Tris,TEMED,β-巯基乙醇,Tricine,SDS,尿素,甘油,过硫酸铵,丙稀酰胺,N,N’-甲叉双丙稀酰胺等电泳试剂,乙腈,三氟乙酸等色谱试剂均购于北京试剂公司;大豆分离蛋白为日本不二制油提供.1.2冻离心防冻JY92-Ⅱ超声波细胞破碎机:上海新芝生物技术研究所制造;GL-20B冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂生产;ECP3000三恒电泳仪及垂直式小型电泳槽:北京六一仪器公司产品;Agilent1100高压液相色谱仪:ODS柱(250mm×4.6mm),二极管阵列检测器,Agilent公司产品.1.3方法1.3.1蛋白酶的附着将4℃保存的菌种在PDA斜面培养基上活化、培养后,加入灭菌后的蒸馏水,震荡1min,制取孢子悬浮液,接在豆腐坯表面,25℃下培养48h,凉花后,得到腐乳毛坯,蛋白酶即附着在毛坯表面菌丝上.1.3.2提取外来和内侧酶1胞外蛋白酶粗液的提取剥取毛坯表面菌丝,加入10倍重量0.3mol/L的NaCl溶液,4℃冰箱中过夜提取,4℃下冷冻离心(10000g),上清液即为胞外蛋白酶粗液.2胞内及胞内蛋白酶的提取和纯化将上述离心后的沉淀,用0.3mol/L的NaCl溶液反复清洗以除去残留的胞外酶,压滤后,加入与胞外蛋白酶制备时同样质量的0.3mol/L的NaCl溶液,冰浴中超声波破碎(800W,15min,每次4s,间隔4s),4℃冰箱中过夜提取,4℃下冷冻离心(10000g),上清液即为胞内蛋白酶粗液.在上述蛋白酶提取液中加入硫酸铵,收集30~70%饱和度,4℃过夜沉淀部分,冷冻离心(10000g)后,用少量缓冲溶液溶解,4℃下透析脱盐、聚乙二醇浓缩,得到胞外及胞内蛋白酶.1.3.3表面活性剂的制备以质量分数2%2mL的大豆分离蛋白为底物,分别用2mL胞外蛋白酶和胞内蛋白酶水解(40℃)2h,用4mL4mol/L的三氯乙酸终止反应,静置10min后过滤,滤液即为胞外和胞内蛋白酶的水解液.空白液为4mL4mol/L的三氯乙酸先与2mL的酶液作用后,再加入2mL的底物溶液,其余操作相同.所有水解液及空白液均经过0.45μm滤膜过滤.1.3.4sds-东南角凝胶电泳对胞外及胞内蛋白酶提取液分别进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)和添加底物明胶的底物凝胶电泳(Gel),分离胶质量浓度为12.5g/dL,浓缩胶质量浓度为3g/dL,30mA稳流,上样量为20μL.Gel不连续凝胶电泳在4℃下进行.SDS电泳为考马斯亮兰R-250染色,体积分数30%甲醇脱色;Gel电泳结束后,用含TritonX-100(5%),pH7.5的磷酸缓冲液漂洗后放入pH7.5磷酸缓冲液中,在37℃下过夜反应后,再氨基黑染色、蒸馏水脱色.1.3.5溶剂b为体积分数的乙腈乙酸洗脱条件进样量:10μL;检测波长:214nm;洗脱液:溶剂A为水(含体积分数0.1%的三氟乙酸);溶剂B为体积分数40%的乙腈水溶液(含体积分数0.08%的三氟乙酸);洗脱条件:梯度洗脱.溶剂B体积分数从10~40%,体积流量为0.7mL/min,14min;从体积分数40~60%,体积流量0.5mL/min,40min;从体积分数60~90%,体积流量0.7mL/min,10min.2结果与讨论2.1培菌对蛋白质活力的影响前期培菌时,毛霉胞外及胞内蛋白酶(粗酶液中)活力的变化见图1.图1表明,前期培菌时,毛酶产生的胞外及胞内蛋白酶活力变化趋势基本相同.在培菌45h以内时,毛霉分泌蛋白酶,水解基质中的蛋白质,作为毛霉生长的氮源,此时,胞外及胞内蛋白酶活力变化较稳定;培菌45h时,开始凉花,毛霉大量分泌蛋白酶,并达到最大酶活,这与生产实践经验是相吻合的;凉花后,可能由于毛霉停止生长,并不再分泌蛋白酶,但蛋白酶向豆腐坯体的渗透还在进行,因此,菌丝附着的蛋白酶活力显著降低.2.2胞外及胞内蛋白酶sds-有效分离纯化蛋白质电泳技术是鉴定蛋白质并分析其纯度的基本工具.20世纪60年代Shapiro建立了SDS方法之后,Weber、Gloss-mann和Douglas等人对其进行了多次改进,使SDS方法在分离、鉴定和纯化蛋白质方面显示出了优越性.胞外及胞内蛋白酶SDS电泳图谱见图2.图2表明:胞外及胞内蛋白酶中均含有若干种蛋白质组分,其中,胞内蛋白质组分显现的谱带略多于胞外蛋白质;同时,胞外和胞内蛋白酶提取液中含有相同位置的谱带,如谱带a、b和e,说明两者中含有相同的蛋白质组分或亚基,也含有不同位置的谱带,如谱带c和d,说明两者中也含有不同的蛋白质组分或亚基.2.3胞外及胞内蛋白酶系的表达在2.1结论的基础上,实验对胞外及胞内蛋白酶进行了Gel活性电泳分析,图谱见图3.图3表明:胞外和胞内蛋白酶都是由几种蛋白酶组成的蛋白酶系,这与人们从生产实践中获得的信息相吻合.以明胶为底物时,二者表现出的活性谱带基本相同,说明胞外及胞内蛋白酶系的相对分子质量组成基本相同.2.4胞外和胞内蛋白酶水解产物的变化腐乳生产中,豆腐白坯除约质量分数70%的水分外几乎全是由大豆蛋白质组成的.将胞外和胞内蛋白酶分别作用于大豆分离蛋白(SPI),水解产物的HPLC图谱见图4~7.图4~7表明:在以大豆分离蛋白为底物时,雅致放射毛霉胞外及胞内蛋白酶的主要水解产物有3种,在胞外和胞内蛋白酶总水解产物中分别占到质量分数83.50%和69.39%;3种水解产物在色谱图中均表现为保留时间在10.5min(a),15.3min(b)和20.9min(c)的3个峰,即胞外和胞内蛋白酶的主要水解产物是相同的,这与2.2中胞外和胞内主要组成蛋白酶是相同的结论相吻合;除3种主要水解产物外,胞外和胞内蛋白酶的其它水解产物出峰的保留时间也相同,仅含量上有差异.3蛋白质系与代谢产物腐乳生产前期培菌时,雅致放射毛霉同时分泌胞外及胞内蛋白酶,两者酶活力变化趋势基本相同,在培菌45h时,达到最大酶活力;胞外和胞内蛋白酶均为蛋白酶系,相对分子质量组成相同,以大豆蛋白为底物时,主要水解产物相同、含量不同.