突变位点的检测课件

Molecular

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Course2主要核酸操作技术核酸凝胶电泳技术1核酸分离技术PCR技术mRNA的纯化和文库的构建基因克隆技术DNA序列分析技术突变位点的检测Molecular

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Course主要内容遗传标记DNA遗传标记基因突变SNPSNP检测技术2Molecular

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Course遗传标记3遗传标记：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记分子标记（Molecular

Markers）广义：可遗传并可检测的特异DNA序列、RNA或蛋白质。狭义：指DNA或RNA标记。DNA遗传标记：指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。DNA遗传标记的种类（P436）：限制性片段长度多态性RFLP、简单重复序列（SSR）、SNP。Molecular

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Course主要内容遗传标记DNA遗传标记基因突变SNPSNP检测技术4Molecular

BiologyCourseDNA遗传标记(P437)5第一代标记：限制性片段长度多态性（RFLP）定义：用限制性内切酶特异性切割DNA链，由于DNA的一个“点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生不同长度的片段，可用凝胶电泳显示多态性。优点：广泛用于检测已知DNA点突变，可以检测大到几千个碱基对DNA片段；对SNP位点检测和基因分型均能较准确的判断。缺点：限制性酶切过程中不可避免的遭遇到酶切不完全或

DNA降解的现象，且只能检测已知多态位点，不能罕见的或未知的突变位点；每次酶切2-3个片段，信息量有限；限制性内切酶价格较昂贵。Molecular

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CourseDNA遗传标记6第二代标记：简单重复序列（SSR）定义：真核生物基因组中散布有由大量由简单重复序列所组

成的微卫星和由串联重复短序列组成的小卫星。在小卫星或

微卫星的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点。通过特

异性引物进行PCR扩增、凝胶电泳和放射自显影（或银染），可以检测到在简单重复序列中由于重复单位数不同而造成的

DNA区域的多态性。优点：与RFLP标记相比SSR检测的多态性频率高得多。应用：基因定位、DNA指纹分析、遗传分析和疾病诊断等。缺点：要克隆足够数量的SSR并进行测序，需要投入足够的资金、人力和时间。Molecular

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CourseDNA遗传标记7第三代标记：SNP定义：基因组DNA序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。SNP是基因组中最简单、最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。已经在人类基因组中发现了超过1000万个SNP位点，平均约每300bp就有一个SNP。绝大多数SNP位于非编码区。优点：可用于检测未知突变；可以与DNA芯片技术相结合实现自动化检测。缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受检测条件影响。Molecular

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CourseDNA遗传标记8依据DNA遗传标记进行基因分型。P473基因型（genotype）：人：除性染色体外，人类细胞内的染色体都有两份，一个人所拥有的一对等位位点的类型被称为--。泛指：同一基因座位上多个等位位点的类型。基因分型（genotyping）：确定某个个体基因型的实验。等位位点（P66）：指染色体DNA同一位置上的每个碱基类型。Molecular

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Course主要内容遗传标记DNA遗传标记基因突变SNPSNP检测技术9Molecular

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Course基因突变10定义：由于体内外各种因素使基因特定的DNA序列的碱基组成或排列顺序发生改变，导致DNA一级结构改变。根据分子机制不同分为：插入突变、缺失突变、点突变。插入/缺失突变：DNA序列插入/缺失一个或多个核苷酸的突变。eg.转座子（复制型转座子、非复制型转座子）。Molecular

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Course基因突变点突变：指一种碱基通过化学修饰、遗传变异、复制错误等引起的单一碱基的改变。分为转换（transition）和颠换（transversion）。转换最常见，约占SNP的2/3。11Molecular

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Course主要内容遗传标记DNA遗传标记基因突变SNPSNP检测技术12SNP

(P66)SNP广泛存在于人类基因组中。单倍/体型（haplotype）：位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称为--。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代（图2-42）。3~4个相邻的SNP标记构成的单体型就可有8~16种。13SNP••SNP分类：根据SNP在基因组中的分布位置，可分为：cSNP（1/5）、pSNP、rSNP。

从对生物遗传性状的影响上看，cSNP又可分为：同义cSNP、非同义cSNP

。SNP的应用（P69）：人类基因单体型图的绘制SNP与疾病易感基因的相关性分析指导用药与药物设计动物、植物、微生物的遗产改造/育种14Molecular

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Course主要内容遗传标记DNA遗传标记基因突变SNPSNP检测技术15SNP检测技术（课下拓展，各技术有何优缺点）

限制性酶切片段长度多态性分析-RFLP

单链构象多态性分析-SSCP

毛细管电泳

变性高效液相色谱-DHPLC

异源双链分析-HA

变性梯度凝胶电泳分析-DGGE

DNA芯片技术-DNA

chip

实时荧光PCR分析

直接序列测定，……PCR16Molecular

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CourseSNP检测技术

PCR-RFLP：原理：先用PCR技术扩增目的基因片段，由于DNA个别碱基的突变，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割目的片段，所产生的片段数目和每个片段的长

度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。P427：17Molecular

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Course突变位点的检测技术单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链

DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象，在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位。优点：简单快速，价廉，特别适合大样本的筛选；用SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，检出率可达70％-95％。缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受凝胶交联度、电泳温度、片断长度等条件影响，当片段大于400bp时，检出率仅为50％左右；同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。18Molecular

BiologyCourse突变位点的检测技术异源双链分析法（HA）原理：由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链

DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁率。优点：HA是SSCP法鲜为人知的姊妹篇，操作也比较简便。HA和SSCP两种方法突变检测模式不同，两种方法可以同时在同一张凝胶上进行，二者可以相互掩盖对方的缺点与不足，使突变检出率提高到近100％。缺点：只能分离双链DNA；也只适合于小片段的分析。19Molecular

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CourseSNP检测技术实时荧光PCR分析原理：使用针对核酸中不同多态性序列的荧光探针，只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割，它们在PCR扩增中被水解切割释放出荧光信号，不同探针标记不同的荧光报道信号。优点：操作方便简单，实验时间是现有方法中最短的，重复性强，适合于大量样本的检测；同时整个实验是在闭管的状态下完成，可以非常有效避免污染；结果判断借助仪器软件自动判读，客观性强。缺点：只能对已知的多态性位点进行分析；需要专门的仪器、试剂。20SNP检测技术基因芯片法(DNA

chip)：原理：又称为DNA微探针阵列（Microarray）。它是集成了大量的密集排列的已知序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。优点：快速简单、自动化程度高，使SNPs的分析更加便捷，具有很大的发展潜力；还可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。缺点：需要专门的仪器、试剂，费用较高。21Molecular

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Course直接测序测定：是诊断未知突变基因最直接的方法，其方法是将PCR产物在自动测序仪上直接测序。优点：操作简便，测序时间短。缺点：费用昂贵，仅适合于小样本量分析。SNP检测技术22思考23简述DNA遗传标记的种类？Molecular

BiologyCourse突变位点的检测技术变性梯度凝胶电泳法（DGGE）原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降；当解链的DNA链中有—个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度不同而被分离。优点：检测片段可达1kb，最适范围为100bp-500bp，如果突变发在最先解链的DNA区域，检出率可达100％；检测结果无假阳性重复性好，准确率高，可判断基因型；该法一经建立，操作也较便，适合于大样本的检测筛选。缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专的电泳装置，合成的PCR引物最好在5’末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。24Molecular

BiologyCourse突变位点的检测技术变性高效液相色谱检测（DHPLC）原理：含有突变位点的PCR

扩增产物经变性、退火，将形成同源和异源双链两种DNA

分子。在部分变性条件下，发生错配的异源双链DNA

更易于解链为单链DNA，与DNASepⓇ柱结合力降低，比同源双链DNA分子更易于被乙腈洗脱下来，从而与同源双链DNA

分离。优点：分离DNA分子快速，操作自动化、简便，经济；PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测；能准确测定DNA片段大小，基因突变检出率高（达95-100%）。缺点：DHPLC

检测的灵敏性、特异性受PCR引物、PCR

体系及反应条件、检测温度、DNASepⓇ柱质量以及流动相梯度等多重影响。25Molecular

BiologyCourse突变位点的检测技术蛋白截断技术（PTT）由于基因的非缺失型突变多可能造成翻译过程的提前终止(突出表现为点突变形成