脂质体介导的内皮抑素基因转移抑制小鼠视网膜新生血管的研究

脂质体介导的内皮抑素基因转移抑制小鼠视网膜新生血管的研究

各种视网膜疾病与新血管有关，如糖尿病性视网膜病变、视网膜血管阻塞和早产儿视网膜病变。阻止新生血管生长是治疗此类疾病的关键。内皮抑素(endostatin,ES)是一种内源性新生血管抑制因子,可以特异性抑制血管内皮细胞的增殖从而抑制新生血管的生长。克隆ESDNA得到的重组ES蛋白半衰期短,而视网膜新生血管生长是一较长期的过程,只有持续性用药,才能在组织中维持稳定、有效药物浓度。将ES基因转入视网膜靶组织内使其持续分泌,达到有效浓度是一个较为理想的方法。本研究通过缺氧诱导的鼠视网膜新生血管动物模型,观察脂质体介导的内皮抑素基因转移抑制视网膜新生血管的作用效果,探讨ES基因转移抑制视网膜新生血管的可行性。材料和方法一、小鼠视网膜新生血管模型根据文献的方法建立小鼠缺氧诱导的视网膜新生血管动物模型,1周龄(生后7d,P7)C57Bl/6N小鼠与母鼠一起置于氧浓度为(75±2)%的氧箱中5d,在生后第12天(P12)回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型。二、脂质体pccda3-es混合物a,b的制备真核细胞表达载体PCDNA3-ES由山东省医学科学院赵跃然教授提供,PCDNA3-ES重组质粒采用碱裂解法制备并纯化。将1μgPCDNA3-ES溶于5μl无血清培养液中稀释,配成A液;3μg脂质体(lipofectamineTM,美国Invitrogen公司)溶于5μl无血清培养液中稀释,配成B液;轻柔混合A、B液,室温下孵育30min,制成脂质体PCDNA3-ES复合物。将1μg空白载体PCDNA3质粒代替PCDNA3-ES配成A液,与B液混合,制备空白载体脂质体复合物。三、试验组和玻璃腔注射小鼠出氧箱后(P12)采用如下分组行玻璃体腔注射。1.第一组ES基因转移组28只,玻璃体腔注射脂质体PCDNA3-ES复合物2μl。2.第2组载体对照组11只,玻璃体腔注射脂质体PCDNA3复合物2μl。3.第三组空白对照组11只,玻璃体腔注射等量PBS。注射后5d,分别进行视网膜铺片、组织切片和免疫组化检查。四、荧光素标记右旋糖酐新生血管模型鼠ES转移组12只,对照组6只,包括3只载体对照,3只阴性对照。小鼠麻醉下上腔静脉注射1ml含25mg荧光素标记的右旋糖酐(美国Sigma公司)。过量麻醉处死动物,摘除眼球,4%多聚甲醛固定2h,显微镜下视网膜铺片,荧光显微镜下观察视网膜血管结构。五、细胞数量的检测新生血管模型鼠ES转染组12只,对照组12只,包括6只载体对照,6只阴性对照。眼球摘除后固定、脱水、浸蜡包埋、6μm厚连续切片,每隔10张切片连续选取5张制备在1张玻片,从通过视乳头的切片开始选取。每个眼球选取10张玻片。过碘酸-雪夫染色,光镜下观察突破内界膜的细胞数量。将总数除以50,计算出每眼每张切片的细胞数量。六、两组患者常规免疫组化检测新生血管模型鼠ES转染组4只,对照组4只,包括2只载体对照,2只阴性对照。分别于注射后1d、3d、1周、2周眼球摘除,冷冻胶包埋,冷冻切片,常规免疫组化检测。Ⅰ抗采用兔抗人ES单克隆抗体(美国AlphaDiagnostic公司),Ⅱ抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司),常规DAB染色,甲绿复染。七、载体载体的制备正常P12小鼠6只,分别取右眼进行实验。2只眼注射ES脂质体复合物2μl,2只眼注射空白载体作为载体对照,2只眼注射2μlPBS作为阴性对照。注射后7d,眼球摘除,显微镜下剪除角膜和晶体,保留眼后段,置于盛有2.5%戊二醛的小瓶中4℃固定12h。经清洗、后固定、脱水、浸透及包埋、切片、染色,JEM-1200EX(日本JEOL公司)投射电镜观察拍照并记录。八、统计评估数据处理通过SPSS10.0软件分析系统进行计算,组间比较采用方差分析,组间两两比较采用其中的LSD检验。结果一、大鼠视网膜新生血管及荧光素渗漏正常P12小鼠视网膜铺片可见视乳头周围放射状分布视网膜血管,血管分布规则,全视网膜毛细血管分为2层,呈网状分布(图1,2)。空白对照组:新生血管模型鼠在氧箱中生活5d后,从视乳头发出的血管数量减少,视乳头周围至中周部视网膜深层毛细血管广泛闭锁,大量无灌注区,无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光素渗漏(图3),其中2只眼有视乳头新生血管及荧光素渗漏。载体对照组:3只眼视网膜均可见大量新生血管芽及荧光素渗漏。ES注射组:12只眼视网膜均可见新生血管芽,但新生血管芽的数量明显减少(图4),未见视乳头新生血管,也未见较明显的荧光素渗漏。二、组患者关联显著性统计f:9.973,p新生血管模型鼠各组均可见突破内界膜的内皮细胞,有的形成血管索。第1组突破内界膜的细胞数量平均为16.99个,第2组为19.01个,第3组为19.13个,差异有统计学意义(F=9.773,P=0.001)。两两比较,1组和2组间差异有统计学意义(P=0.002);1组和3组间差异有统计学意义(P=0.001);2组和3组间差异无统计学意义(P=0.859)。三、视网膜神经纤维层细胞阳性染色注射后1d视网膜神经节细胞层可见棕色颗粒,位于细胞中,外核层可见甲绿染色。注射后3d可见染色颗粒增多,部分内核层细胞也可见棕色阳性颗粒(图5)。载体对照及阴性对照未见染色(图6)。注射后1周仍有染色未见数量减少。注射后2周仍可见部分视网膜神经纤维层细胞阳性染色。载体对照及阴性对照未见棕色颗粒,仅见甲绿染色颗粒。四、透射电子显微镜检查结果ES注射后视网膜各层结构清晰,排列正常,细胞核圆形或椭圆形,染色质分布正常,可见外界膜(图7,8)。讨论一、糖尿病视网膜病变动物模型的评价视网膜新生血管的动物模型有多种,各有其优缺点。可采用电凝、光凝等方法造成动物视网膜的静脉阻塞,伴发一定比例的眼内新生血管。这种动物模型的优点是可以选取较大的动物模型,缺点是新生血管的形成率仅为50%,另外此种新生血管在荧光素眼底血管造影中荧光素不易渗漏,需通过组织学检查来评定结果。糖尿病动物模型有多种,但常因眼底仅为背景期的糖尿病视网膜病变在视网膜新生血管的研究中受到限制。目前应用最为广泛的方法即采用氧致血管增生性视网膜病变的动物模型。小鼠模型新生血管的发生率为100%且可重复性好,而且有可定量的最大优点,已成为探索视网膜新生血管发生机制和新生血管治疗方法疗效评价的主要实验动物模型之一。C57Bl/6J小鼠生后2周内视网膜血管发育尚不成熟,此时给予高氧的环境,抑制血管的发育成熟,而回到正常环境中后可以引发缺血、缺氧,从而使新生血管生长。评价新生血管的指标有两种,一种是可以通过视网膜铺片上血管生长的范围密度、新生血管芽的多少来反映视网膜新生血管的增殖程度。另一种方法即通过组织学计数切片上血管内皮细胞突破内界膜的数目反映新生血管的增生状态。前者是定性方法,后者是定量方法。我们在研究中发现采用此方法建立的新生血管动物模型中,100%的小鼠发生视网膜新生血管,与国外同类报道一致。二、局部和局部相互影响的原因多项研究表明ES是一种内源性新生血管抑制因子,可以特异性抑制血管内皮细胞的增殖。有研究报道动物实验可通过抑制肿瘤新生血管的生长从而抑制多种肿瘤的生长。携带ES的各种载体进行全身或局部的基因转移也取得较好效果。ES是否对眼部新生血管有抑制作用?对此我们采用小鼠新生血管模型局部转移ES基因的方法观察ES对视网膜新生血管的作用。在本研究中,ES基因转移使新生血管芽的数量和程度减少,这可能与ES抑制血管内皮细胞增殖的特性有关。目前研究认为新生血管性疾病的局部存在着刺激因子和抑制因子的平衡。Noma等对血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和ES水平与糖尿病视网膜病变的关系进行研究,发现房水中和玻璃体中VEGF和ES水平与糖尿病视网膜病变的严重程度相关,两者之间的浓度差别与糖尿病视网膜病变是否处于活动期有关。另一项研究观察增生性糖尿病视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)的玻璃体手术预后与玻璃体腔中VEGF和ES水平之间的相关性,发现在玻璃体液中VEGF水平在视网膜病变进展组较非进展组高。相反,ES在非进展组较进展组高,而且发现玻璃体中VEGF水平高、ES水平低者术后发生糖尿病视网膜病变进展的可能性增大。这说明促进因子水平高一定程度上反映血管处于增生活跃期,抑制因子水平高一定程度上反映了血管增生的相对稳定。我们通过基因转移的方式,上调局部的抑制因子水平,对抗促进因子的作用,使血管的增生活跃受到抑制而达到治疗目的。ES基因转移不能完全抑制新生血管的生长,主要有以下几个原因。首先视网膜新生血管生长是一个较为复杂的过程,有多种因子参与。目前认为是促进因子和抑制因子的平衡开关控制新生血管生长的过程。因此可能单一因素不能阻止新生血管的发生。这提示我们:是否多个环节控制新生血管生长具有更有效的作用?另外脂质体介导的基因转移在视网膜的表达量受到限制,而蛋白因子类的作用效果呈明显的量效关系。提高脂质体的转移效率及优化转移条件是否在一定程度上提高治疗效果是今后所要研究的问题。三、动物模型新生血管的移植质粒DNA与重组病毒相比,具有操作简便、可以容纳更大的插入序列、容易产生、整合和扩散的危险小等特点。另外质粒DNA的抗原性低可以重复使用。但质粒直接注射方法的缺点是效率较低,仅具有非常低的稳定整合水平,很难达到在细胞中长期表达。对于增殖比较旺盛的细胞需重复注射,对于增殖率较低的细胞,注入的质粒DNA可以达到持续基因表达几个月之久。脂质体是由脂质双分子组成的环形封闭囊泡、无毒、无免疫原性,脂质体DNA复合物成为非病毒载体基因转移的较好方法。本研究可以看出,基因注射后可以转移至视网膜细胞,主要位于神经节细胞和内核