细胞凋亡与无菌性松动

细胞凋亡与无菌性松动

人工关节置换术是治疗关节疾病的有效方法之一，它可以减轻关节疼痛，重建活动功能，改善生活质量。然而随着假体植入时间的延长,假体无菌性松动影响了人工关节的长期稳定性和使用寿命,因此需行翻修手术。目前全世界每年有超过100万台关节置换手术,翻修手术已经达到同期关节置换手术的20%,其主要原因是人工关节发生的无菌性松动。而人工关节远期松动最常见的原因是假体磨损产生的颗粒诱发假体周围组织细胞产生一系列生物学反应,导致假体周围骨溶解。大量研究证实,翻修术中取下的界膜组织里可看到大量磨损颗粒,磨损颗粒在多种动物模型身上均可引起骨质溶解,并可引起体外培养的巨噬细胞的炎性反应。假体周围的组织细胞吞噬理化性质稳定的磨损颗粒后,这些细胞的降解功能受挫,因体内的酶不能使其降解,而磨损颗粒引起细胞自身功能活性的改变,诱导细胞损伤,出现细胞凋亡,结果已被吞噬的磨损颗粒再次释放到细胞外基质中,诱导新的炎性细胞来吞噬,磨损颗粒被反复吞噬后导致激活的细胞分泌更多的炎性细胞因子和蛋白酶水解酶,从而诱导、维持,甚至加剧慢性炎性反应,导致假体周围骨量丢失。假体松动的直接原因是骨溶解所引起的骨性支持结构力学性能下降造成假体机械稳定性丧失,中间摩擦、磨损、磨损颗粒及其所发生的骨吸收、骨缺损、骨溶解在假体松动机制中扮演重要角色。1体外地质及细胞凋亡世上无永不磨损的材料,只要有相对界面接触运动,必然会产生磨损颗粒。磨损颗粒随着关节运动渗透到假体与骨之间界膜或更远间隙,纤维界膜继而成为假体松动生物学因素作用空间。Hardinge等首先在临床上发现松动假体周围有一层界膜组织并通过对假体周围组织学观察,认为术后无菌性松动主要与假体长期磨损产生的微粒所诱导的生物学反应有关。Jasty等在取界膜组织进行组织学观察时发现含有大量的T淋巴细胞、浆细胞和肥大细胞,界膜的巨噬细胞内可见亚微米的金属微粒,认为在这层界膜上发生的组织细胞反应对假体松动起着重要作用。之后大量研究证实,无菌性松动的假体周围界膜组织中存在细胞凋亡现象,细胞凋亡参与磨损颗粒诱导的假体无菌性松动的病理过程,且与caspase-3信号激活有关。Landgraeber等研究证实翻修术中取出的界膜组织存在巨噬细胞、异物巨细胞、T淋巴细胞凋亡现象,凋亡调控基因caspase-3、bak、p53表达阳性。假体周围界膜组织caspase-3的表达和细胞凋亡具有一定规律性,并与磨损微粒的局部聚积和骨溶解程度密切相关,可能是磨损颗粒造成界面骨重建受阻而溶骨大量发生的关键环节之一。程涛等采用免疫组化法及TUNEL检测翻修术中取出的界膜组织,发现重度磨损处细胞凋亡指数高于轻度磨损处,松动或骨溶解组caspase-3阳性细胞率和细胞凋亡指数明显高于松动或非骨溶解组和对照组。Huk等等应用TUNEL染色、DNA琼脂糖凝胶电泳以及蛋白质印迹法分析界膜组织的天然多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)溶解片段等实验技术证实,界膜组织中存在明显的细胞凋亡且凋亡现象和假体周围骨溶解密切相关。这些现象均说明磨损颗粒诱导的慢性炎性反应与细胞凋亡存在一定的关系。2caspase-3诱导诱导凋亡细胞凋亡又称程序性细胞死亡,死亡受体活化和线粒体损伤途径是细胞内两条经典的凋亡途径,内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径。细胞凋亡的发生是由caspase家族介导的蛋白酶级联反应过程,凋亡的最后过程是通过caspase的激活而实现。caspase-3被认为是在多种诱导刺激后导致凋亡的关键酶,是凋亡过程中所特有的。caspase-3的升高早于细胞发生凋亡,因此,它的活化预示着细胞凋亡执行阶段的开始。细胞发生凋亡后虽不能释放大量炎性介质,但在清除这些已经死亡的细胞时,巨噬细胞同样会释放炎性因子,引发炎性反应,而这些炎性反应往往是假体周围骨溶解的起始点,当细胞内的酶不能降解其内的磨损产物时,磨损产物被再次释放到细胞外基质中,导致更多的炎性细胞因子和蛋白水解酶的释放,形成恶性循环,从而维持甚至加剧慢性炎性反应,最终导致假体周围骨溶解的发生。3带炎性介质的骨水泥磨损颗粒及tnf-b信号传导途径检测无论假体采用何种材质或何种固定方式,术后关节摩擦和微动必然会产生颗粒,磨损颗粒主要有:骨水泥颗粒、超高分子聚乙烯颗粒、金属颗粒及陶瓷颗粒等。而微粒的产生又会在假体周围产生异物反应,激活细胞因子,加剧微动和关节摩擦,两者相互促进,最终导致假体松动。磨损颗粒在假体周围骨溶解的发生和发展过程中起着关键性作用。磨损颗粒可诱导吞噬细胞释放IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2等炎性介质,这些炎性介质在促进破骨细胞分化、成熟及功能活动过程中起着最主要作用,通过一系列生物反应,激活破骨细胞,从而刺激细胞凋亡及破骨细胞吸收骨质,造成假体周围骨溶解,最终导致假体松动。Greenfield等研究发现将钛颗粒与鼠骨髓细胞或人外周血共培养,能使破骨细胞分化的细胞因子量增加20~30倍。Ingham等将不同成分的骨水泥磨损颗粒和同位素45Ca标记过的小鼠颅盖骨以及U937单核细胞共培养,结果培养上清液中标志着骨溶解的45Ca在各实验组中均高于对照组。Warashina等将陶瓷和高分子聚乙烯等3种磨损颗粒分别直接植于小鼠的颅盖骨上,1周后处死动物,取颅盖骨分析,结果显示植入的磨损颗粒处颅盖骨均出现了骨溶解,结果表明磨损颗粒可以导致骨溶解。Baumann等将聚乙烯颗粒、TiALV颗粒与THP-1单核细胞共培养,结果发现培养上清液中NF-κB和TNF-α启动子均高于对照组,并认为在颗粒诱导巨噬细胞炎症反应直至假体周围骨溶解的整个过程中NF-κB信号传导途径起着关键作用。Stea等发现细胞凋亡与磨损颗粒种类有关,含金属颗粒的界膜组织细胞凋亡率最高为24%,其次是超高分子聚乙烯颗粒为2.8%,陶瓷颗粒为1.5%,而不含磨损颗粒的界膜组织为6%。3.1金属磨损3.2不同磨损颗粒诱导的细胞凋亡磨损产生的聚乙烯和陶瓷颗粒诱导吞噬细胞释放炎性介质,通过一系列生物学反应,造成假体周围骨溶解。Yagil-Kelmer等将陶瓷磨损颗粒与U937细胞共培养,发现上清液中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-α的含量明显高于对照组。聚乙烯和陶瓷磨损颗粒诱导的细胞凋亡也参与假体无菌性松动的病理过程。Warashina等将钛合金、聚乙烯、氧化铝陶瓷和氧化锆陶瓷4种磨损颗粒植于小鼠颅骨,1周后取颅骨观察,结果发现这4种磨损颗粒的骨溶解区均较对照组升高。Petit等实验证实聚乙烯和陶瓷颗粒能够诱导TNF-α的释放,促进caspase-3的表达以及细胞凋亡。以上实验说明聚乙烯和陶瓷颗粒也通过caspase途径诱导细胞凋亡并参与无菌性松动的过程。3.3骨水泥颗粒可以诱导细胞凋亡关节置换术后会在体内产生大量骨水泥颗粒,这些颗粒不能被机体清除而在界膜上聚积,从而引起一系列反应。Horowitz等发现巨噬细胞吞噬骨水泥颗粒后导致了TNF-α的释放并抑制巨噬细胞对H3-胸腺嘧啶的摄取,说明此类颗粒不仅能激活巨噬细胞,而且对其具有毒性。体外研究证明,骨水泥颗粒可以诱导细胞凋亡。Cimpan等发现骨水泥颗粒增大了人体单核细胞样细胞株(uq37)的凋亡和死亡,用鼠成纤维细胞株(L929)做实验,同样发现增大了细胞的凋亡和坏死,其中以凋亡为主。Granchi等研究了骨水泥对淋巴细胞的影响,测试细胞的生存率、早期细胞凋亡事件、细胞前凋亡基因(pro-p53,c-myc,ICE)和抗凋亡基因(bcl-2等)的表达,发现骨水泥有修改淋巴细胞凋亡程序的能力且与时间有关。Pioletti等证实骨水泥颗粒通过caspase途径诱导成骨细胞凋亡,从而参与无菌性松动的过程。因此,骨水泥颗粒也能诱导细胞凋亡从而参与无菌性松动的过程4磨损微粒对骨关节炎的影响在松动的界膜组织中存在着大量的磨损颗粒,这些磨损颗粒被吞噬后可诱导吞噬细胞凋亡。细胞凋亡与假体周围骨溶解有关并参与了假体无菌性松动的病理过程。赵建宁等发现聚乙烯、钛合金、骨水泥组假体隧道边缘的组织细胞含量明显高于对照组,并可见巨噬细胞浸润,各实验组组织中的TNF-α含量明显高于对照组。磨损微粒能诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE22和NF-κB等炎性因子的产生,而这些因子与骨关节炎的发病风险密切相关。Rego等认为存在TNF-α依赖的细胞凋亡现象。Valdes等也认为TNF受体家族在细胞凋亡中起到了重要作用。许多学者认为这些因子可能与无菌性松动的发生发展密切相关。Schwarz等报道TNF-α基因敲除的小鼠对骨溶解有很高的耐受性。Childs等在鼠模型中阻断TNF-α的活性,能部分抑制破骨细胞的分化和骨溶解。Godoy-Santos等认为,IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2和NF-κB都具有类似作用。因此,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2和NF-κB都参与骨溶解和无菌性松动的过程并在其中发挥重要作用。体外实验已经证实,聚乙烯、陶瓷、金属、骨水泥磨损微粒能够导致细胞凋亡,界膜组织中参与炎性反应的细胞主要是巨噬细胞、单核细胞、破骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞以及骨髓基质干细胞等。4.1金属离子检测巨噬细胞是磨损颗粒靶向作用最重要的细胞。磨损微粒可引起假体周围巨噬细胞凋亡、坏死,刺激假体周围活性细胞分泌各种炎性因子而介导假体周围骨溶解,还可通过引起巨噬细胞调亡及破坏成骨细胞、破骨细胞与成纤维细胞之间的平衡等导致假体松动。Haynes等发现钛合金和Co-Cr微粒可以使巨噬细胞寿命缩短,介质释放下降。Huk等和Catelas等在体外将Co2+和Cr3+与单核-巨噬细胞共培养,发现细胞死亡方式取决于金属离子浓度和培养时间,体外培养24h可通过caspase-3途径导致单核-巨噬细胞凋亡。Petit等发现bcl-2、caspase家族在钴微粒诱导的单核-巨噬细胞凋亡调控中起着重要作用。单核或巨噬细胞的凋亡参与了假体周围骨溶解的病理过程,此外,单核或巨噬细胞的凋亡会引起更多的单核或巨噬细胞聚集,不仅坏死的单核或巨噬细胞释放炎性介质,而且在清除这些死亡细胞时也释放各种炎性介质,引发大量炎性反应,而炎性反应通常又是假体周围骨溶解的起点,从而加重假体周围骨溶解和假体松动。4.2激活破骨细胞松动的关节与骨界面之间有一层纤维组织膜,透射电镜下主要见到巨噬细胞和成纤维细胞,这两类细胞在颗粒介导骨溶解过程中起重要作用。界膜组织中的巨噬细胞、成纤维细胞及多核巨细胞均具有吞噬颗粒的能力,但它们与颗粒反应的程度和作用不尽相同。成纤维细胞吞噬磨损颗粒后会释放许多生物活性物质,分泌一些促骨溶解因子,促进破骨细胞分化,参与关节松动和骨溶解的病理过程。松动的假体周围界膜中IL-6和TNF-α水平要明显高于无松动假体周围组织。Sun等研究发现IL-6和TNF-α是激活成纤维细胞的主要因子。Kang等通过HE染色法在界膜中频繁观察到成纤维细胞的存在,被激活的成纤维细胞在巨噬细胞刺激下促进骨吸收反应。成纤维细胞吞噬磨损微粒后可以通过caspase途径促进凋亡。Olivier等发现聚乙烯颗粒可诱导成纤维细胞凋亡且与颗粒浓度相关。Renò等研究证实,松动假体界膜有成纤维细胞凋亡现象,caspase-8阳性的细胞主要是成纤维细胞,对照组的感染界膜组织则无凋亡,caspase-8位于肿瘤坏死因子受体(TNFR)-1促发的凋亡途径上游,界膜组织中存在caspase-8阳性的成纤维细胞,表明存在TNF-α依赖的细胞凋亡,亦即成纤维细胞凋亡的原因可能是TNF-α激活caspase-8。因此,成纤维细胞的凋亡也参与到了无菌性松动的过程中。4.3促进骨吸收的因子虽然认为成骨细胞为非吞噬细胞,但体外研究证实这种细胞具备吞噬功能。磨损颗粒可引起成骨细胞自身功能受到抑制、增殖能力减弱、胞外基质分泌减少,进而引起邻近骨基质形成减少,还可诱导成骨细胞凋亡。Pioletti等发现将3种不同成熟阶段的成骨细胞与钛、骨水泥颗粒置于体外共培养,颗粒通过caspase途径诱导成骨细胞凋亡,且细胞成熟度越低,凋亡率越高,体内情况亦如此。成骨细胞吞噬微粒后可引起细胞凋亡,这源于吞噬微粒引起的细胞直接毒性反应及在吞噬过程中或吞噬后,成骨细胞释放的炎性因子对其他成骨细胞的毒性反应(属间接作用)。Pioletti等还发现成骨细胞吞噬钛颗粒后产生对其他成骨细胞有毒性的物质并诱导成骨细胞凋亡,提示假体周围微环境中,颗粒在局部的聚集严重影响成骨细胞功能,高浓度钛颗粒及死亡细胞释放的可溶性因子可直接或间接引起骨溶解。局部大量磨损颗粒通过假体-骨界膜可激发巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞释放潜在的细胞炎性介质及其代谢副产物。但是破骨细胞表面不存在这些因子的受体,不能对其发生反应,而成骨细胞恰好相反。这些促进骨吸收的因子主要通过维生素D3受体途径、蛋白激酶A途径以及gp130途径等作用于成骨细胞,使成骨细胞表达骨吸收信号,并通过特定的信号转导通路作用于破骨细胞前体和破骨细胞,进而使破骨细胞分化成熟、激活,同时促进破骨细胞从骨膜释放、转移、黏附到骨质表面最终诱发溶骨作用。磨损颗粒作用于成骨细胞的生物学反应是双相的,且反应程度因颗粒大小和作用时间的不同而又有所不同。Wu等发现钛颗粒刺激成骨细胞产生大量促骨吸收因子(IL-6、ODF)的同时快速而短暂地释放抑骨吸收因子(IL-10)。同时,在对人工关节翻修术后界膜的分析时,也确实发现其中包含一定浓度的IL-4、IL-10等抑骨吸收因子和高浓度的PGE2、TNF、IL-1和IL-6等促骨吸收因子。TNF等炎性介质可以通过成骨细胞的凋亡参与无菌性松动的过程。Thammasitboon等报道在牙骨中,LPS(脂多糖类)可以引起成骨细胞凋亡,并证实TNF是引起成骨细胞凋亡的中间介质。Hock等认为TNF引起成骨细胞凋亡,并会由此影响成骨细胞和破骨细胞的平衡,进而影响骨代谢。Hallab等和Cunningham等报道在脊柱内固定时,在固定物周围的组织中TNF含量升高,细胞凋亡数目增加,并认为和人工关节松动一样,存在磨损颗粒释放后,刺激TNF等炎症介质分泌机制。将磨损颗粒PE、Co-Cr-Mo、Ti-6A1-4V刺激体外培养单核细胞thp-1可分泌TNF-α,同时将磨损颗粒刺激单核细胞thp-1的条件培养基在体外培养成骨细胞,可以引起成骨细胞凋亡。单核巨噬细胞吞噬磨损颗粒后局部分泌的TNF可以引起成骨细胞凋亡,进一步影响成骨细胞和破骨细胞之间的平衡,导致骨溶解和骨吸收,最终引起人工关节的松动。4.4破骨细胞在骨重建的代谢转换过程中,破骨细胞的凋亡率对维持破骨细胞群的大小和骨组织自身平衡至关重要,破骨细胞的消失是细胞凋亡的结果。若破骨细胞凋亡过早,凋亡细胞数目增加,破骨细胞数目减少,则旧骨被吸收的范围减少;反之,则吸收的范围增大。MacQuarrie等研究证实在骨髓培养中施加5000次循环微应力后可抑制破骨细胞分化,加入磨损颗粒后,仍进一步抑制破骨细胞分化;单独施加机械应力可诱导破骨细胞凋亡,加入聚乙烯和骨水泥磨损颗粒可抑制应力诱导的破骨细胞凋亡,加入钛颗粒和钴、铬颗粒则诱导细胞凋亡。机械力学变化和磨损颗粒引起的不良反应可相互影响、相互促进而形成恶性循环,最终导致细胞凋亡和假体松动。金属离子的影响似乎取决于破骨细胞分化阶段。Nichols等研究表明100μg/L的钴、铬离子能诱导骨髓前破骨细胞凋亡。而Rousselle等发现104μg/L钴、铬离子不会引起成熟破骨细胞凋亡。因此磨损颗粒和机械刺激相互作用,通过改变不同分化阶段的破骨细胞的功能和存活从而参与到无菌性松动的过程中。5ers与nf-b的关系及作用以往认为微米级颗粒是诱导骨溶解的主要微粒,但是随着激光捕获显微切割技术(LCM)和透射电镜(TEM)的引入,在松动界膜组织中发现了各种纳米级微粒,包括金属纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、高分子聚乙烯纳米颗粒。由于纳米级微粒更易被吞噬细胞所吞噬,因而在无菌性松动中可能扮演了更为重要的作用。最新研究表明,纳米颗粒可以在不同细胞系引起内质网应激反应(ERS)和细胞凋亡,同时产生明显的生物学反应并促进TNF-α等炎性介质的释放。而ERS可以导致NF-κB的核易位以及TNF-α等炎性介质的释放。也能诱导ROS信号转导通路,激活NF-κB和JNK通路并能产生急性炎症相关因子,而这些炎性因子与无菌性松动关系密切。此外,缺氧和氧化应激导致的细胞氧化还原规律的失调也能触发ERS。种种迹象表明,ERS可能与纳米颗粒诱导的骨溶解之间有着一定的关系。Wang等研究发现在金属纳米磨损颗粒处理过的巨噬细胞、骨溶解动物模型的骨膜组织以及临床上的假体松动标本中ERS的标志物显著升高。应用ERS特异性抑制剂4-PBA大大减少了纳米颗粒粒子在体外和体内的炎症性细胞因子表达。此外,在金属纳米磨损颗粒处理过的巨噬细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α等松动相关细胞因子表达水平上调,加入4-PBA后细胞因子表达降低;在PIO动物模型内,应用4-PBA能显著抑制破骨细胞的分化并减少溶骨反应。因此,内质网应激反应在纳米磨损颗粒诱导骨溶解中起着关键作用。虽然对纳米颗粒及其产物的细胞毒性机制仍不很清楚,但随着研究的进展,纳米颗粒在细胞摄取及其随后的生理反应中的作用已逐渐被人们所熟知。可是,对于假体周围产生的磨损微粒能否引发内质网应激反应并诱导骨溶解还有待进一步的研究。抑制内质网应激反应有可能成为无菌性松动新的治疗方法。6细胞凋亡及其基因调控人工关节置换随着假体植入时间的延长会在体内产生大量的磨损颗粒,这些理化性质稳定的磨损颗粒在与界膜组织周围的细胞接触或被吞噬后可诱导假体周围界膜的慢性炎症反应,引起细胞凋亡或内质网应激反应,最终导致假体周围骨溶解以及无菌性松动的发生。由于不会引起炎症反应,细胞凋亡或内质网应激可能是未来无菌性松动新的治疗方法。人工关节无菌性松动是一个多因素相互作用、相互调节的极为复杂的过程。而磨损微粒引起的细胞凋亡引起无菌性松动是近年来新的发现,许多因素仍未确