产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究

产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究厌氧发酵微生物概述1产甲烷菌分类及代谢途径2产甲烷菌富集与纯化3微生物群落研究方法4分子多样性研究5内容厌氧发酵微生物概述不产甲烷菌产甲烷菌纤维素降解细菌半纤维素降解细菌淀粉降解细菌脂肪降解细菌产琥珀酸丝状菌溶纤维丁酸弧菌白色瘤胃球菌牛链球菌溶脂厌氧弧菌产氢产乙酸菌同型产乙酸菌挥发酸生成菌群基质分解菌群沃尔夫互营单细胞菌中温丙酸氧化菌伍德乙酸杆菌乙酸梭菌嗜热自养梭菌嗜甲基丁酸杆菌提供生长和产甲烷所需要的基质创造适宜的氧化还原电位条件为产甲烷菌清除有害物质厌氧发酵微生物的发展史1901-1903年巴斯德研究所的Maze马氏甲烷球菌.HABarker发现沼气发酵分为产酸和分解酸形成甲烷两个阶段1950美国R.E.Hungate发明厌氧培养技术1868

Bechamp甲烷形成是微生物学过程1899俄国奥姆良将厌氧分解纤维的微生物分为两类1916奥氏甲烷杆菌1901荷兰Sohngen氢和二氧化碳的混合气能发酵成甲烷1967

Bryant采用改进Hungate技术纯化产甲烷菌1972三阶段理论1974

Bryant首次提出了产甲烷菌(Methanogen)一词更先进的技术更完善的体系……产甲烷菌的生物学特性专性厌氧1生长繁殖困难2-320mV下正常生长

-160mV下生长缓慢

遇氧停止生长甚至死亡十几天~几十天才出现菌落菌落一般圆形、透明、边缘整齐菌落特别小，很容易遗漏。可利用的底物很少：CO2、H2、乙酸、甲醇、甲基胺等产甲烷菌的生物学特性特殊的细胞壁结构独特的产甲烷菌辅酶甲烷吠喃(MFR)甲烷喋呤辅酶M(CoM)辅酶F430辅酶F420HS-HTP无肽聚糖骨架蛋白质亚基和大量杂多糖组成不受青霉素抑制细胞内无细胞色素C34脂蛋白肽聚糖脂多糖孔道蛋白产甲烷菌的分类根据可利用底物根据生长温度氢营养型：利用氢气和二氧化碳乙酸盐营养型：乙酸甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇嗜冷产甲烷菌：Topt<25℃了苔原湿地、湖底沉积物嗜温产甲烷菌：Topt

≈35℃厌氧消化器、淡水沉积物嗜热产甲烷菌：Topt

≈55℃海底沉积物、热泉等极端嗜热产甲烷菌：Topt>

80℃产甲烷菌甲烷生产途径H2/CO2途径乙酸途径甲基途径CO2+H2→CH4+2H2OΔG′0=-131kJ4CH3OH→3CH4+CO2+2H2O

ΔG′0=-319kJCH3COO-+H2O→CH4+HCO3-ΔG′0=-31kJCO2+H2→CH4+2H2OΔG′0=-131kJ4CH3OH→3CH4+CO2+2H2O

ΔG′0=-319kJCH3COO-+H2O→CH4+HCO3-ΔG′0=-31kJ产甲烷菌的分类颗粒污泥外观特征颗粒污泥表面的菌群马氏甲烷球菌巴氏甲烷八叠球菌甲酸甲烷杆菌产甲烷菌的分类产甲烷菌显著影响因子第一PPT模板网，PPT素材下载/sucai/

微量元素缺乏会导致VFA高，气体产率下降。对毒性物质具有拮抗作用使反应器内优势菌种发生变化使乙酸利用率提高数倍。微量元素硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存在竞争关系，二者都以氢、乙酸、乳酸等为电子供体。硫化氢致害浓度为50mg·L-1，驯化后的500mg·L-1。硫酸盐最适pH值6.8~7.4pH值的变化可引起微生物体表面的电荷变化，影响培养基中有机化合物的离子化作用酶只有在最适宜的pH值时才能发挥最大活性。产甲烷菌最适宜的Eh为-350mV或更低，过高则停止生长甚至死亡。中温Eh应低于-300~-380mV高温厌氧消化系统-500~-600mVpH值氧化还原电位(Eh)产甲烷菌富集与纯化方法样品采集繁殖培养纯化分离纯度检验水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂培养基配好后先煮沸数分钟厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2培养10天后，重复上述过程四次。滚管分离涂片染色检验滚管观察在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。菌种保存进行沼气发酵试验看其是否产生沼气4:1的H2/CO2，放置在4℃保存用悬浮液冷冻保存法保藏产甲烷菌微生物群落研究方法进展原位杂交菌落杂交Southern印迹杂交斑点印迹杂交狭线印迹杂交荧光原位杂交核酸探针杂交技术复性RNADNA利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可以是长探针(100~1000bp)，也可以是短的寡核苷酸(10~50bp)。根据所用的探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA(核糖核酸)杂交，RNA–RNA杂交3类微生物群落研究方法进展核酸探针杂交技术荧光原位杂交能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等荧光原位杂交((FluorescenceInSituHybridization，FISH)是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用分子生态学方法。用荧光标记探针，原位鉴定单个细胞,可原位分析它们的空间及数量分布。微生物群落研究方法进展PCR-DEEG变性梯度凝胶(DGGE)和温度梯度凝胶(TGGE)：在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE)，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度(TGGE)。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析。

PCR-DEEG可以半定量地测定样品DNA浓度的大小，反映微生物群落组成的变化。微生物群落研究