流式细胞仪检测技术与方法的研究进展

流式细胞仪检测技术与方法的研究进展

中医是中国古代人民长期疾病斗争经验和理论的总结，对中华民族的兴衰起到了不可替代的作用。为了更好地发挥中医药的医疗效果,迫切需要精密准确的检测技术和方法对中医药的作用机制和机理进行研究。流式细胞仪(FlowCytometer,FCM)以荧光显微镜与血球计数原理为基础,利用荧光染料技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,从同一个单细胞中同时测得多种参数,为从细胞和分子生物学水平认识中医药提供了可靠的检测手段。1流式细胞仪的工作原理1.1检测系统和光学系统流式细胞仪主要由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管(PMT)和检测系统、计算机和分析系统四部分组成,如图1所示。流动室和液流系统:流动室有样品管、鞘液管和喷嘴等,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流系统的液流压力下从样品管射出,鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出激光源和光学系统:激光源是氩离子气体激光管,发射488ηm波长激光,激发经荧光染色的细胞发出荧光信号,强弱与激光强度和照射时间相关。光学系统由透镜、小孔、滤光片等组成,分为流动室前和流动室后两组。流动室前光学系统将激光束聚焦成横截面较小的椭圆形,以使通过激光检测区的细胞受照强度一致。流动室后的光学系统将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。光电管和检测系统:光电管为光电倍增管(PMT),将荧光染色细胞的荧光通过光电转换器转变成电信号传输到检测系统放大器。放大器有两类,一类放大器输出信号辐度与输入信号成线性关系,适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系,在免疫学测量中常用。计算机和分析系统:经放大后的电信号被送往计算机多道分析器,多道道数和电信号的脉冲高度相对应,也和光信号强弱相关,对应道数纵坐标代表发出该信号的细胞相对数目。由多道分析器出来的信号,再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件进行计算机存贮,可脱机进行数据处理和分析。1.2荧光染料检测使用流式细胞仪进行检测时,将待测细胞放入样品管中,细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。由于鞘液压力与样品流压力不同,在二者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。如果将细胞中需要研究部分标上荧光染料,这些染料在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光照射,通过一定波长选择通透性的滤色片,可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来,送到不同的光电倍增管中,经过一系列的信号转换、放大,数字化处理,在计算机上直观统计染上各种荧光染料细胞的各自百分率。选择不同单克隆抗体及荧光染料,可利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多种不同特征。如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。2流式细胞仪在中医学研究中的应用2.1cdi表现为细胞免疫功能低下的原因采用流式细胞仪分别测定慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺气虚证患者、肺阴虚证患者和健康体检者的外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+数值。与健康体检者比较,肺气虚证和肺阴虚证组CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高,差异均有统计学意义;肺阴虚证组CD3+降低,差异有统计学意义,肺气虚证组差异无统计学意义。肺阴虚证组与肺气虚证组比较,CD4+/CD8+降低,差异有统计学意义;CD3+、CD4+降低,CD8+升高,但差异无统计学意义。表明COPD肺气虚证与肺阴虚证患者均存在细胞免疫功能低下,其中肺阴虚证患者细胞免疫功能受抑更为明显对符合气阴两虚、血瘀内阻型难治性血小板减少性紫癜(RITP)患者和健康对照人群外周血采用流式细胞仪进行免疫学指标检测。结果显示RITP患者体内CD3+CD25+T、CD3+HLA2DR+T、CD45RA+PRO+T、γδT、NKT、Th细胞亚群均发生了异常变化,差异具有显著性。表明气阴两虚、血瘀内阻证型的RITP患者的免疫功能出现紊乱。通过收集缺血性心力衰竭患者临床资料,按照中医证候分为气虚、阴虚、阳虚、血瘀、痰阻、水饮6个证候要素和心肺气虚、气阴两虚、心肾阳虚、气虚血瘀、阳虚水泛、痰饮阻肺6个证候分型。采用流式细胞仪检测外周血干细胞(PBSC)数量,得出阳虚证PBSC数量最少,与气虚、阴虚、痰浊和血瘀证比较,差异有统计学意义,与水饮证比较差异无统计学意义。各中医证候分型组PBSC数量差异无统计学意义。表明缺血性心力衰竭患者的中医证候与PBSC有相关性,呈现阳虚证候患者PBSC数量减少的特点。2.2大黄素体外抑制细胞凋亡的活性使用黑龙江省五常地区人工种植的一年生块茎白附子,洗净去皮,切成薄片于室温(20~30℃)晾干,粉碎。95%乙醇溶液回流提取两次,合并滤液,选乙酸乙酯萃取为浓缩物。将对数生长期的人胃癌的SGC-7901细胞以5×105mL-1接种于50mL培养瓶中,加入白附子提取物使各瓶质量浓度分别为0、0.72、7.2mg·L-1,24h后收集细胞。测试结果与对照组比较显示,随着药物浓度的增加,G0/G1期和S期细胞所占比例减少,G2/M期细胞所占比例增多,表明白附子提取物使胃癌SGC-7901细胞阻滞于G2/M期;凋亡率随着药物浓度的增加而显著升高。用陕西省西安药品检验所提供的大黄素标准品(纯度98%),进行大黄素体外抑制人树突状细胞(DC)分化及成熟作用的研究。实验分为不成熟树突状细胞组6例,大黄素刺激组(大黄素组)8例,未经大黄素刺激组(对照组)6例。选取100μg/mL的大黄素为最佳作用浓度,使用流式细胞进行树突状细胞表面分子表达及细胞因子分泌分析。结果显示:大黄素组CD80、CD86、CD83的表达显著低于对照组,CD14显著高于对照组。表明体外大黄素的刺激可抑制人DC的分化及成熟。建立同型半胱氨酸诱导的人主动脉血管内皮细胞损伤模型为对照组,同时将损伤模型与不同浓度葛根素(10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L)共同培养为葛根素组流式细胞仪测定含量并分析细胞周期。得出葛根素组G0/G1期细胞数明显减少,S期细胞数明显增多,且存在剂量依赖性,与同型半胱氨酸组相比差异显著,表明葛根素具有拮抗同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞凋亡的作用。2.3各组大鼠细胞亚群和nk细胞水平的比较在研究复方苦参方剂对大肠癌LoVo细胞体外增殖凋亡的影响中,复方苦参由苦参、黄芪、丹参、甘草、半枝莲等中药组成,经煎煮法制成水溶液,每毫升含生药2g。收集经药物作用48h的大肠癌LoVo细胞,在流式细胞仪分析DNA含量及细胞周期。测试结果为LoVo细胞可检测亚Gl峰,凋亡率与对照组相比有明显升高,细胞周期分析发现S期细胞比例明显增高,呈现出S期阻滞现象。表明复方苦参方剂具有一定的抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用。研究左归丸(由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、川牛膝和龟胶组成)、右归丸(由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂和附子组成)对EAE大鼠淋巴细胞亚群和NK细胞的影响时,实验设对照组、模型组、激素组、左归丸组、右归丸组。经流式细胞仪检测淋巴细胞亚群及NK细胞水平显示:造模后第15d,左归丸组CD4+细胞显著升高,与正常组、激素组比较有显著差异,与模型组比较差异不明显;模型组CD4+/CD8+比值高于正常组差异不明显;左归丸组CD4+/CD8+比值显著高于正常组。造模后第27d,各实验组CD4+细胞与正常组无明显变化;激素组CD8+细胞明显低于正常组;右归丸组CD8+细胞明显高于激素组;模型组CD4+/CD8+比值明显高于正常组;左归丸组CD4+/CD8+比值明显低于模型组。研究参知健脑片对β淀粉样蛋白对人神经母细胞瘤细胞株(SH2SY5Y)凋亡的保护作用,参知健脑片由人参、知母、芍药等组成,作用于SH2SY5Y模型,用具有神经营养作用的APP17肽为对照药物。分组给药并培养24h,流式细胞仪定量分析表明,参知健脑片作用后,SH2SY5Y细胞凋亡峰和凋亡率明显降低,细胞内活性氧水平也明显降低,显示参知健脑片能抑制细胞凋亡其保护作用可能与参知健脑片可降低细胞内活性