促性腺激素抑制激素的研究

促性腺激素抑制激素的研究

促进腺激素激素（gnih）是2000年首次发现的一种含有12个氨基酸的精氨酸苯丙胺（rci）神经武器。例如，gnih的神经元细胞主要位于脑的旁边。由于它能抑制山羊背部前叶细胞（pgi）激素的释放，因此将其称为激素激素抑制激素。随后,克隆了其受体,并对GnIH及其受体在下丘脑-垂体-性腺轴的分布定位、生理功能、作用机制等进行了研究。在哺乳动物也发现了GnIH的类似物,有3种,其C端具有RF酰胺,称RF酰胺相关肽(RFRP),具有与GnIH类似的作用。GnIH的发现,是对动物生殖调控研究的一个新突破。1合成rf酰胺fmrf-nh的活性化合物早在30年前,在软体动物(蛤)的神经节发现了具有心兴奋作用的神经肽-苯丙氨酰-甲硫氨酰-精氨酰-苯丙酰胺(FMRF酰胺)(Price等,1977),随后在其他无脊椎动物发现了C端具有RF酰胺模体的神经肽,Dockray等人(1983)首先在脊椎动物(鸡)发现了RF酰胺(LPLRF酰胺)肽。一些研究发现FMRF酰胺阳性神经元投射至垂体附近的下丘脑区,提示他们具有调节垂体功能的作用。因此,Tsutsui等人推测鸟的下丘脑可能含有调节垂体功能的RF酰胺肽,并于2000年用HPLC和竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)从日本鹌鹑脑内分离提纯了RF酰胺肽,测定了其氨基酸序列,确定为C端含有RF酰胺的12肽(SIKPSAYLPLRF-NH2)。以后发现该肽分布于鹌鹑的下丘脑-垂体系统,并呈剂量依赖性降低培养的垂体前叶促性腺激素的释放,将其命名为促性腺激素抑制激素(GnIH)。2鸡的rfrp基因及结构鹌鹑的GnIH为12肽,其氨基酸序列为Ser-Ile-Lys-Pro-Ser-Ala-Tyr-Leu-Pro-Leu-Arg-Phe。GnIH由前体肽裂解产生,其前体肽含有173个氨基酸残基,可编码1个GnIH和2个GnIH相关肽(GnIH-RP-1和GnIH-RP-2),GnIH相关肽(GnIH-RP)C端含有LPXRF(X为L或Q)酰胺(图1)。所有这些肽的序列具有甘氨酸C端酰胺化信号和两端单碱基内蛋白水解(endoproteolytic)位点。Gambel白冠麻雀的GnIH前体也由173个氨基酸组成,编码1个GnIH和2个C端含有LPXRF(X为L或Q)酰胺的GnIH-RP。尽管鹌鹑与麻雀GnIH前体的同源性为66%,但GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2C端的结构均相同。Ikemoto和Park(2005)克隆了鸡的RF酰胺相关肽(GnIH),其cDNA含971bp,包括5′-UTR(38个核苷酸)、ORF(519个核苷酸)、中止密码codon(TGA)和3′-UTR(411个核苷酸)。ORF可编码含有173个氨基酸的RFRP前体(prepro-RFRP)。翻译的起始点为+39~+41位点ATG,3′-UTR在多A尾的上游含有标准的多腺苷酸polyadenylation信号(AATAAA)。鸡的RFRP也包括GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2三部分,其GnIH的序列与鹌鹑的仅有第3位上氨基酸不同(SIRPSAYLPLRF-NH2),每一部分均有酰胺化/蛋白水解加工信号(甘氨酸和单碱基残基)。鸡的RFRP由3个外显子和2个内含子组成,所有3个5′-和3′-分裂位点均含有相同的5′-GT和3′-AG,2个内含子在ORF内的位置与人和大鼠的相似,其长度分别为1735和874bp。Kriegsfeld等人(2006)克隆了叙利亚仓鼠GnIH前体部分序列,含有2个LPXRF(X为L或Q)序列,与小鼠和大鼠RFRP及白冠麻雀和鹌鹑GnIH的同源性分别为81%、77%、43%和42%。Hinuma等通过genedatabase研究发现了哺乳动物GnIH的类似结构和受体,人的基因至少可编码3个RF酰胺相关肽(hRFRP-1~3),这些肽及其受体(OT7T022)在大鼠的下丘脑表达,给大鼠脑室注射hRFRP-1可以增加催乳素的分泌。Sawada等克隆了金鱼的LPLRF酰胺肽,其前体含197个氨基酸残基,可产生3种C端具有LPXRF(X为L或Q)酰胺的肽,即gfLPXRFa-1、gfLPXRFa-2和gfLPXRFa-3,后者的序列为SGTGLSATLPQRF-NH2。Ukena等报道了青蛙C端具有LPXRF酰胺的神经肽,由于他可刺激生长激素的分泌,命名为生长激素释放肽(fGRP),其前体可分裂产生fGRP及其相关肽(fGRP-RP-1~3),fGRP-RP-2可刺激催乳素的释放,但对促性腺激素无影响。3gnih-ir+dmh-神经元/细胞的表达免疫组化研究发现,鹌鹑的GnIH免疫阳性神经元主要分布于下丘脑室旁核(PVN),为腹侧部的小细胞;一些散在的小神经元也见于隔区。GnIH的分布无明显的性别差异。原位杂交研究表明GnIH在下丘脑室旁核表达。但免疫阳性纤维在间脑和中脑广泛分布,致密的免疫阳性纤维网络见于腹侧旧纹状体、隔区、视前区、下丘脑和视顶盖,最显著的纤维见于下丘脑的正中隆起(ME)和延髓的迷走神经背侧运动核。在麻雀,GnIH免疫阳性神经元分布于下丘脑室旁核,免疫阳性纤维见于多个脑区,包括正中隆起和脑干。繁殖季节末期鸟的GnIH神经元比其他时期的大,与该神经肽调节季节性繁殖的作用一致。双标记和共聚焦技术研究指出GnIH纤维和GnRH-1神经元在视前区密切接触,GnIH和GnRH-1纤维在正中隆起接触,与该肽调节垂体促性腺激素的作用一致。Ubuka等报道欧掠鸟(starling)GnIH神经元位于下丘脑室旁核,纤维末梢存在于正中隆起外层及分别存在GnRH-I和GnRH-Ⅱ神经元胞体的视前区和中脑;GnIH终末与GnRH-I和GnRH-Ⅱ神经元接触;在GnRH-I和GnRH-Ⅱ神经元上有GnIH受体mRNA表达。这些结果提示GnIH可在脑水平通过GnRH调节促性腺激素的释放。Kawano等人报导日本草原(牧场)蜥蜴的GnIH-ir细胞位于伏隔核、室旁核和延髓上部,来自室旁核的GnIH-ir纤维与室旁器官(PVO)血清素(5-羟色胺)样神经元的外侧突接触。Kriegsfeld等报道仓鼠、大鼠和小鼠的GnIH免疫阳性(GnIH-ir)细胞体集中在下丘脑背内侧核(DMH),大多数为双极和三极细胞,面积为(622.52±17.81)μm2,细胞数和纤维分布在仓鼠无性别差异。在其他脑区未见免疫阳性细胞。原位杂交研究发现GnIHmRNA仅在DMH表达。GnIH-ir纤维和终末在GnRH神经元和纤维集中的脑中线区普遍存在,也在不含GnRH神经元和纤维的许多脑区存在,向前投射至中线、边缘区(隔区、视前区、杏仁核和终纹床核),向前腹侧投射至下丘脑前区和弓状核,向后投射可达后脑和管周灰质,稀疏的GnIH-ir纤维见于正中隆起(ME),大多数位于靠近第3脑室的内层。双标记和共聚焦显微镜研究发现,在母仓鼠,大于40%的GnRH细胞接受来自GnIH系统的投射,除统计的轴-体接触外,还见到许多轴-树接触。在大鼠和小鼠也观察到类似到结果。再则,母仓鼠的GnIH-ir细胞(39.41±2.06)%表达性腺类固醇受体(ERα),雄仓鼠的GnIH-ir细胞表达AR。此外,Ubuka等研究了日本鹌鹑GnIH的发育变化,发现GnIH前体mRNA在10日龄胚胎(E10)的间脑表达,在孵出前的E17显著增加。GnIH也在E10的间脑表达,在接近孵出时显著增加。随后间脑的GnIH含量临时降低,以后再次逐渐增加直到成年。GnIH-ir神经元在E10位于室旁核,但GnIH-ir纤维未伸至正中隆起。在E17,室旁核的GnIH-ir神经元增加,GnIH-ir纤维与成年一样伸至ME的外侧。这提示GnIH在孵出前后作为鸟类下丘脑促性腺激素释放的调节者而发挥作用。Ciccone等报导,青年母鸡(30周)与老龄母鸡(60周)下丘脑总的GnIH和GnRHmRNA无差异。4rpr-cdna的结构GnIH通过其受体发挥作用。Yin等根据大鼠RFRP(鸟类GnIH的同祖肽)受体的序列设计克隆了日本鹌鹑的GnIH受体,证明其为具有7次跨膜结构域的G蛋白耦联受体(GPCR),与GnIH和GnIH-RP有高的结合力。鹌鹑GnIH受体长1479bp,ORP为1197bp,分子量为45.7ku,编码399个氨基酸残基。GnIH受体mRNA在鹌鹑的垂体、大脑、间脑、中脑和脊髓表达,在间脑、中脑和脊髓含量较高。结果提示GnIH通过其受体直接作用于垂体调节促性腺激素的分泌。Ikemoto和Park报导鸡的RFRP(GnIH)有两种受体(RFRPR和NPFFR),RFRPRcDNA由1442bp组成,包括5′-UTR(32个核苷酸)、ORF(1197个核苷酸,编码399个氨基酸残基)、中止密码codon(TGA)和3′-UTR(210个核苷酸)。翻译的起始点与其他动物RFRPR的基本相似,3′-UTR在多A尾上游含有单个标准的AATAAApolyadenylation信号。NPFFRcDNA由1524bp组成,包括5′-UTR(77个核苷酸)、ORF(1266个核苷酸,编码422个氨基酸残基)、中止密码codon(TGA)和3′-UTR(178个核苷酸)。翻译的起始点与其他动物NPFFR的基本相似,3′-UTR在多A尾上游含有AATAAA的变异体。RFRPR和NPFFR属于GPCR,为rhodossin/β肾上腺素能受体样受体(GPCR家族A)成员,但克隆的受体不具有GPCR家族A的结构特征,TM3和第2细胞内环(IC2)结合处保守的DYR模体修饰为ERF(RFRPR)和DRF(NPFFR)。RFRPR和NPFFR均由4个外显子和3个内含子组成,除NPFFR的第1个内含子外,所有内含子位于ORF,RFRPR和NPFFR的第2和第3个内含子分别位于第1个细胞外环(EC1)和IC2。RFRPR主要在垂体表达,在间脑、端脑、视顶盖和嗅球也表达。NPFFR在多种组织表达,包括间脑、垂体、端脑、视顶盖、小脑、嗅球、延髓、脊髓、眼球、卵巢、睾丸、心房、心室、肝、肾上腺、脾。Bently等发现鸡GnIH的结合点在中脑为GnRH-Ⅱ神经元或靠近他,在正中隆起靠近GnRH-Ⅰ末梢。Maddineni等报导GnIH受体(GnIHR)mRNA在鸡的睾丸和卵巢(膜细胞层和颗粒细胞层)表达,prehierarchial卵泡GnIHRmRNA的量高于排卵前的卵泡,性成熟鸡卵巢GnIHRmRNA的量比性未成熟鸡卵巢显著降低,用雌二醇(E2)和/或孕酮(P4)处理性未成熟鸡显著降低卵巢GnIHRmRNA的丰度。提示GnIHR影响卵泡的成熟。5生理功能研究GnIH及其受体在神经系统和多种组织分布,表明他具有多种生理功能,但目前仅对其参与生殖调控的作用研究较多,其他作用也在逐步进行研究。5.1gnih作促性腺激素生物合成因素GnIH在体内、外均抑制促性腺激素的分泌。GnRH与原代培养的鹌鹑垂体前叶细胞作用100min后,呈剂量依赖性显著抑制LH的释放,其阈值浓度范围为10-9~10-8mol/L。对FSH的释放有类似的趋势,但作用不显著;对PRL的释放无作用。给麻雀注射GnIH(2min)能快速减少血浆LH水平,同时注射GnIH和鸡的cGnRH-I,能降低GnRH诱导的血浆LH的升高。给去卵巢仓鼠脑室或外周注射GnIH,能快速减少LH浓度,最有效剂量的抑制作用可维持30min。这些结果表明,GnIH可作为鸟类和哺乳动物促性腺激素的抑制因子。GnIH可抑制促性腺激素的生物合成。给短期培养(120min)的成年鸡垂体块添加GnIH抑制LH和FSH的释放,抑制共同的α和FSHβ促性腺激素亚单位mRNA的表达,对LHβ亚单位mRNA无影响。经过渗透泵给成年公鹌鹑连续2周给予GnIH,呈剂量依赖性降低促性腺激素共同的α和LHβ亚单位mRNA的表达,血浆LH和睾酮浓度也呈剂量依赖性降低。此外,也诱导睾丸的凋亡,降低睾丸的生精活动。在未成年鸟,连续2周每日给予GnIH抑制正常的睾丸生长,升高血浆睾酮浓度。给予GnIH后也出现对青年鸟换毛的抑制作用。这表明GnIH通过降低促性腺激素的合成和释放抑制性腺的发育和维持。GnIH对动物的性行为也有一定的影响。给雌鸟中枢注射GnIH30min之后,其交配请求行为比对照组显著减少。5.2gnih、gnih-rp-2对鸡的摄食影响GnIH具有促进动物摄食的作用。Tachibana等人报导,给鸡脑室内注射GnIH、GnIH-RP-1和GnIH-RP-2显著刺激鸡的摄食,GnIH抗血清抑制禁食引起的摄食,但不改变自由摄食条件下的摄食。这些结果表明GnIH及其相关肽为鸡脑内源性的增食因子。6gnih对大鼠血清anh的调节作用关于GnIH调控动物生殖的作用机制,可能有几种方式。一是GnIH在垂体水平影响促性腺激素的合成和释放。在鹌鹑的垂体有GnIH受体,GnIH在体内、外抑制LH的释放,抑制促性腺激素共同的α亚单位及LH和FSHβ亚单位的合成。上述结果均可说明这一点。二是GnIH在下丘脑水平通过GnRH调节生殖活动。在仓鼠的GnIH免疫阳性细胞上存在性腺类固醇激素受体,GnRH细胞或纤维与GnIH纤维接触,提示他接受CnIH的直接投射,进而通过GnRH影响LH和FSH的分泌。在鸟类,GnIH纤维也与GnRH细